RNA 產(chǎn)品應(yīng)用
Oplr16 通過多能特異性染色體環(huán)和 TET2 介導(dǎo)的 DNA 去甲基化來調(diào)控干細(xì)胞的命運(yùn)
Oplr16 Serves as a Novel Chromatin Factor to Control Stem Cell Fate by Modulating Pluripotency-Specific Chromosomal Looping and TET2-mediated DNA Demethylation
發(fā)表期刊
Nucleic Acids Research
影響因子
IF=11.15
發(fā)表期刊位置
中科院雜志分區(qū) 1 區(qū)
通訊作者所在單位
吉林大學(xué)第一醫(yī)院
伯豪生物提供的產(chǎn)品或服務(wù)
伯豪生物 RNA 測序
研究路線

圖 A 研究路線圖
主要結(jié)果
1、確定了 Oplr16 是多能干性相關(guān) lncRNA,進(jìn)行亞細(xì)胞定位,同時(shí)證明 Oplr16 是維持干細(xì)胞多能性所必需的
潛在的多能性相關(guān)的 lncRNA 應(yīng)滿足兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)能力,首先,具有調(diào)節(jié)干細(xì)胞核心因子基因例如 Oct4,Sox2 和 Nanog 的能力。其次,響應(yīng)多能性狀態(tài)而差異表達(dá)。本文作者提出了一種新穎的策略來尋找滿足這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的潛在 lncRNA。使用染色質(zhì) RNA 原位逆轉(zhuǎn)錄測序(CRIST-seq)方法確定哪些 lncRNA 與 Oct4 啟動(dòng)子相互作用,然后使用常規(guī)的 RNA 轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)來鑒定可能與多能性重編程相關(guān)的差異表達(dá)的 lncRNA。RNA-seq 用于鑒定在重編程過程中收集的成纖維細(xì)胞和 iPSC 之間差異表達(dá)的 RNA。進(jìn)一步鑒定 Oplr16 是多能性相關(guān)的 lncRNA。作者分離了細(xì)胞質(zhì)和核 RNA 進(jìn)行亞細(xì)胞分級測定。RT-PCR 顯示,Oplr16 主要位于細(xì)胞核中(圖 1C)。RNA-FISH 分析也驗(yàn)證了其在 iPSC 中的核定位(圖 1D)。這些結(jié)果表明 Oplr16 是在體細(xì)胞重編程過程中被激活的小鼠核 lncRNA。

為了確定 Oplr16 在多能性中的作用,作者收集了擬胚體分化過程的不同時(shí)間的細(xì)胞利用用 qPCR 方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn) Oplr16 與多能性狀態(tài)呈正相關(guān),在擬胚體分化過程中與 Oct4,Sox2 和 Nanog 具有相似的表達(dá)模式。
2、RNA 逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)捕獲測序(RAT-seq)
使用 RNA 逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)陷阱測序(RAT-seq)方法來分析 Oplr16 的靶基因。分析顯示 Octr16 在 Oct4 基因座富集,在啟動(dòng)子區(qū)域有一個(gè)峰,對照大鼠在該基因座處未顯示結(jié)合峰。定量 PCR 也顯示 Oplr16 在 Oct4 的啟動(dòng)子區(qū)域富集。

3、染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)(3C)發(fā)現(xiàn) Oplr16 通過招募 SMC1 維持染色質(zhì)的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)
研究團(tuán)隊(duì)先前已發(fā)現(xiàn)了啟動(dòng)子 - 增強(qiáng)型染色體內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu),對于啟動(dòng)和維持干細(xì)胞多能性至關(guān)重要。本研究也使用染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(3C)的方法驗(yàn)證 Oplr16 是否參與該染色質(zhì)內(nèi)環(huán),結(jié)果檢測到 E14 細(xì)胞的多能性相關(guān) 3C 環(huán),但敲除 Oplr16 可以改變這種染色體內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。使用 SMC1 RNA 染色質(zhì)免疫沉淀(RIP)分析 Oplr16 與 SMC1 相互作用。
4、甲基化分析 Oplr16 招募 TET2 誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞 DNA 去甲基化并激活 Oct4,增強(qiáng)重編程。
啟動(dòng)子甲基化分析檢測 Osclr8 對 Oct4 啟動(dòng)子甲基化是否有保護(hù)作用,另通過 RT-PCR 方法檢測重編程過程中 3 種 TET 的表達(dá),應(yīng)用 lncRNA 染色質(zhì)免疫共沉淀方法檢測 TET 蛋白是否與 Oplr16 結(jié)合明確 lncRNA Oplr16 與 TET 結(jié)合片段。

本文結(jié)論
多能特異性染色質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的形成是體細(xì)胞重編程為多能性狀態(tài)的關(guān)鍵。研究人員利用“染色質(zhì) RNA 原位逆轉(zhuǎn)錄測序”(CRIST-SEQ) 分析了與多潛能主控基因 Oct4 相互作用的 RNA 成分,研究發(fā)現(xiàn)了核 lncRNA Oplr16 與重編程的啟動(dòng)密切相關(guān)。Oplr16 不僅與 Oct4 的啟動(dòng)子相互作用調(diào)節(jié)其活性,還在重編程為多能性的過程中被特異性激活,激活表達(dá)的 Oplr16 是胚胎干細(xì)胞維持多能性所必需的,Oplr16 還能促進(jìn)成纖維細(xì)胞重編程為多能細(xì)胞。RNA 逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)的 TRAP 測序(RAT-SEQ) 結(jié)果表明,Oplr16 與多個(gè)與干細(xì)胞自我更新相關(guān)的靶基因相互作用。Oplr16 利用其 3’端片段招募染色質(zhì)因子 SMC1 來調(diào)控多能特異性染色體內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)的形成。在與 Oct4 啟動(dòng)子結(jié)合后,Oplr16 招募 TET2 誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞 DNA 去甲基化并激活 Oct4,增強(qiáng)重編程。這些研究數(shù)據(jù)表明 Oplr16 作為一個(gè)關(guān)鍵的染色質(zhì)因子可能通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和 DNA 去甲基化來調(diào)控干細(xì)胞的命運(yùn)。
微信原文:https://mp.weixin.qq.com/s/eZaKiF5l4aKOv-o2i-6NhA