單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)科研、臨床診斷、藥物研發(fā)等領(lǐng)域提供了諸多全新發(fā)現(xiàn)視角?，F(xiàn)階段主流的單細(xì)胞測(cè)序，大多是基于 10X?Genomics、BD Rhapsody 等單細(xì)胞捕獲設(shè)備獲得 cDNA 后進(jìn)行打斷、擴(kuò)增、建庫(kù)，并用二代測(cè)序分析基因的整體定量。然而，基因在不同組織、不同細(xì)胞亞群中會(huì)使用 mRNA 的不同轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)也包括 InCRNA；此外 SNV、融合基因等結(jié)構(gòu)變異也具有組織和細(xì)胞特異性，目前基于二代測(cè)序的單細(xì)胞數(shù)據(jù)局限于 3'或 5' 端的 100~150bp，因此較難滿足這類需求：而傳統(tǒng)的 Smart-seq 雖然可以實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本覆蓋，但轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析需要經(jīng)過(guò)組裝且細(xì)胞通量較低，成本較高，研究單細(xì)胞水平的可變剪切仍然較為困難。

三代測(cè)序如 Pacbio、Nanopore 等技術(shù)能夠以其長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)解決這一痛點(diǎn)。因此，如果能將二代測(cè)序與三代測(cè)序相結(jié)合，既能獲得 mRNA 的全長(zhǎng)序列，并通過(guò) Cell?Barcode 信息定位到細(xì)胞亞群，即可解決這一單細(xì)胞研究領(lǐng)域的痛點(diǎn)。但是，我們?cè)谇捌跍y(cè)試中發(fā)現(xiàn)，二代單細(xì)胞測(cè)序一般獲得約 3 萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)矩陣，三代全長(zhǎng)測(cè)序能獲得超過(guò) 10 萬(wàn)個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)矩陣，兩套數(shù)據(jù)的聚類圖譜差異巨大，現(xiàn)有的分析流程并未很好的解決兩套數(shù)據(jù)的整合問題。因此，如何從龐大的二代 + 三代，也即基因 + 轉(zhuǎn)錄本的單細(xì)胞數(shù)據(jù)中，挖掘到有價(jià)值的特異性轉(zhuǎn)錄本，能夠?yàn)閱渭?xì)胞臨床轉(zhuǎn)化、藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)帶來(lái)更加精細(xì)的挖掘角度。

伯豪生物基于十多年的單細(xì)胞組學(xué)服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，可提供從樣品保存、運(yùn)輸、單細(xì)胞懸液制備，到單細(xì)胞分選、建庫(kù)和數(shù)據(jù)分析的解決方案。同時(shí)，及智醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)出身單細(xì)胞科研服務(wù)行業(yè)，重點(diǎn)圍繞單細(xì)胞富集與檢測(cè)平臺(tái)、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)平臺(tái)和基于 AI 算法的單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析算法平臺(tái)。建立了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞聯(lián)合 Bulk 多組學(xué)等多種獨(dú)特的分析流程和方法，尤其擅長(zhǎng)各類免疫細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞的分類、功能解析、細(xì)胞互作、藥物靶點(diǎn)篩選等分析項(xiàng)目。最終通過(guò)積累的上百種單細(xì)胞分析方法與百萬(wàn)級(jí)別單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù)，為單細(xì)胞臨床轉(zhuǎn)化類項(xiàng)目提供專業(yè)研發(fā)服務(wù)。團(tuán)隊(duì)生信專家通過(guò)高效的自動(dòng)化分析腳本，并歷時(shí)數(shù)月的二代 + 三代單細(xì)胞算法測(cè)試，目前已經(jīng)解決了二代 + 三代單細(xì)胞聚類的諸多分析難點(diǎn)。

伯豪生物與及智醫(yī)學(xué)強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，正式推出單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序服務(wù)，即單細(xì)胞 cDNA 水平的轉(zhuǎn)錄、遺傳變異研究，通過(guò)一次捕獲，兩次建庫(kù)，同時(shí)獲得單細(xì)胞聚類與轉(zhuǎn)錄本信息：

目前，該技術(shù)方向?yàn)槿缦驴蒲袉栴}，提供了潛在的解決辦法：

1、發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞攜帶的突變，攜帶突變的細(xì)胞與非突變細(xì)胞相比、攜帶不同突變類型的細(xì)胞相比，挖掘基因表達(dá)規(guī)律；

2、挖掘功能基因，如膜蛋白、分泌蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等編碼基因的轉(zhuǎn)錄本使用情況，并發(fā)現(xiàn)全新功能的轉(zhuǎn)錄本；

3、發(fā)現(xiàn)融合基因所在的細(xì)胞亞群，研究它們與其它腫瘤細(xì)胞的擬時(shí)序分化關(guān)系；

4、發(fā)現(xiàn)亞群特異性的全新 IncRNA；

5、獲得亞群特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，能夠輔助小核酸類藥物開發(fā)企業(yè)，針對(duì)該特異性轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì) siRNA 干擾片段，提升小核酸干擾靶點(diǎn)的有效性。

案例解析

2021 年 11 月 11 日，來(lái)自澳大利亞 ? 沃爾特 - 伊麗莎霍爾醫(yī)學(xué)研究所的 Tian 等人開發(fā)了一種基于 Nanopore 測(cè)序和 10X?Genomics 的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組單細(xì)胞測(cè)序方法，分析單細(xì)胞中的全長(zhǎng)異構(gòu)體、可變剪接和突變檢測(cè)。研究成果發(fā)表在國(guó)際知名期刊 GenomeBiology (IF=13.6)，論文題目為 "Comprehensive?characterization?ofsingle-cell?full-length?isoforms?in?human?and?mouse?with?long-read?sequencing"。

文章中，使用 10X Genomics 技術(shù)分選得到單細(xì)胞的全長(zhǎng) cDNA 后，將 cDNA 一分為二，一份進(jìn)行打斷建庫(kù)用于二代測(cè)序，另一份進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增建庫(kù)用于 Nanopore 三代測(cè)序。此時(shí) Nanopore 的文庫(kù)上也包含了細(xì)胞 Barcode, 后續(xù)可以通過(guò)分析流程將三代測(cè)序和二代測(cè)序結(jié)果通過(guò)細(xì)胞 Barcode 一 一 對(duì) 應(yīng)。通過(guò)這樣的方式，即實(shí)現(xiàn)了獲得全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，分析亞群的特征性轉(zhuǎn)錄本使用，并同時(shí)拿到了突變所在細(xì)胞。

文章數(shù)據(jù)分析顯示其中 40%-60% 的 Nanoporereads 可以分配給預(yù)期的 Barcode, 并保留用于后續(xù)分析（圖 C)。在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中，非全長(zhǎng)且不能唯一分配給轉(zhuǎn)錄本的數(shù)據(jù)被丟棄。最終每個(gè)細(xì)胞的平均 UMI 為 10,000 至 60,000 個(gè)，并且與對(duì)應(yīng)的短讀數(shù)據(jù)情況相符（圖 D)。Nanopore 和 Ilumina 數(shù)據(jù)的基因水平的 UMI 計(jì)數(shù)也高度一致（圖 E）

文章數(shù)據(jù)分析顯示其中 40%-60% 的 Nanoporereads 可以分配給預(yù)期的 Barcode, 并保留用于后續(xù)分析（圖 C)。在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中，非全長(zhǎng)且不能唯一分配給轉(zhuǎn)錄本的數(shù)據(jù)被丟棄。最終每個(gè)細(xì)胞的平均 UMI 為 10,000 至 60,000 個(gè)，并且與對(duì)應(yīng)的短讀數(shù)據(jù)情況相符（圖 D)。Nanopore 和 Ilumina 數(shù)據(jù)的基因水平的 UMI 計(jì)數(shù)也高度一致（圖 E）

通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)，CLL(慢性淋巴細(xì)胞白血?。┘?xì)胞相比正常免疫細(xì)胞具有更高比例的新型轉(zhuǎn)錄本，特別是新型剪接的轉(zhuǎn)錄本。同樣，相比激活的干細(xì)胞，靜態(tài)肌肉干細(xì)胞也有更高比例的新型轉(zhuǎn)錄本（圖 D)。

分析發(fā)現(xiàn)，約 80% 的基因可以表達(dá)多種轉(zhuǎn)錄本（圖 E)，但是大多數(shù)基因主要表達(dá) 1 到 2 種轉(zhuǎn)錄本類型（圖 F)，約 30% 的基因含有多于一種的可變剪接事件，意味著 2 個(gè)最高表達(dá)的異構(gòu)體可能涉及多個(gè)外顯子的復(fù)雜剪接變化而產(chǎn)生不同。

文章通過(guò)分析 CLL 數(shù)據(jù)，檢測(cè)到 CD45 的多種亞型（圖 G)，CD45 的表達(dá)通過(guò) CITE-seg 進(jìn)行驗(yàn)證。CITEseg 可以同時(shí)檢測(cè) RNA 和細(xì)胞表面蛋白，這種方法結(jié)合三代測(cè)序，可以對(duì)細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行更深入的分析和探索。

對(duì) CLL 數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，尋找只存在于癌細(xì)胞中的，且在不同的 CL 轉(zhuǎn)錄簇中具有不同等位基因頻率的 SNVS，通過(guò)經(jīng)典的曼哈頓圖最終發(fā)現(xiàn)四個(gè)變異在不同的 CLL 聚類呈現(xiàn)顯著差異（圖 C， 圖 ?D)。其中發(fā)現(xiàn)的 Gly101Val 突變，此突變已被證實(shí)通過(guò)降低 BCL2 對(duì) venetoclax 的親和力而使患者對(duì) venetoclax 治療產(chǎn)生耐藥性，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)患者 CLL2 攜帶約 25% 的 GIV101Va| 突變，并發(fā)現(xiàn)該突變不僅屬于亞克隆，而且與特定的轉(zhuǎn)錄簇相關(guān)（圖 E)。

單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序的樣品選擇與實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)

由于單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序需要對(duì) mRNA 反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序，核心是需要將完整的全長(zhǎng) cDNA 擴(kuò)增至 2ug 的 ?Nanopore 建庫(kù)起始量，而常規(guī)單細(xì)胞是將一鏈 cDNA 做基礎(chǔ)擴(kuò)增后全部打斷用來(lái)做建庫(kù)測(cè)序，因此，這一實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)就意味著單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序需要額外質(zhì)控。

一、樣品選擇：

常規(guī)單細(xì)胞測(cè)序樣品來(lái)源分為新鮮采集與液氮速凍兩種類型，兩種類型的樣品需要兩種處理方式，新鮮采集樣品需要在 48h 內(nèi)制備懸波并上機(jī)，液氮速凍樣品需要將細(xì)胞膜破碎，丟棄細(xì)胞質(zhì)，分離提取細(xì)胞核，用單個(gè)核來(lái)做單細(xì)胞測(cè)序。

不過(guò)，由于細(xì)胞核里面的 RNA 大多為初始 RNA，包含有較多內(nèi)含子，而從初始 RNA 加工為成熱 mRNA 的過(guò)程大多發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，因此，抽核類的項(xiàng)目并不太適用于單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序。雖然在 2022 年 7 月份一篇 Nature?Biotechnoloey 的文章是對(duì)人腦抽核后的單細(xì)胞樣品進(jìn)行三代全長(zhǎng)測(cè)序，不過(guò)由于拿不到成熟 mRNA，文章是站在了特定基因在不同亞群的外顯子保留這樣的科研角度統(tǒng)計(jì)規(guī)律（如下圖）。文章角度非常新穎，也是科研界首次用單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，人腦中某些基因在不同亞群中使用不同的外顯子組合，生成多種編碼蛋白。不過(guò)，由于最終拿到的仍舊是細(xì)胞核內(nèi)的 RNA，后續(xù)還需要大量驗(yàn)證工作，因此抽核后做單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值較小。所以，單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序的項(xiàng)目最適宜采集新鮮樣品制備細(xì)胞懸液，捕獲成熟 mRNA 開展后續(xù)驗(yàn)證工作。

經(jīng)三代單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序發(fā)現(xiàn) CADMI 基因在人腦神經(jīng)元（興奮性、抑制性）、星膠、小膠、少突細(xì)胞亞群中，會(huì)使用不同的外顯子組合。原文也有用蛋白質(zhì)譜技術(shù)對(duì)這些外顯子的多肽產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證的工作。

二、懸液質(zhì)控：

在收集到新鮮樣品之后，可以使用單細(xì)胞組織保護(hù)液（伯優(yōu)?單細(xì)胞組織保存液）將樣品在 24h-48h 內(nèi)從臨床運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行懸液解離，并通過(guò)顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)懸液質(zhì)量。

由于全長(zhǎng)單細(xì)胞對(duì) RNA 質(zhì)量要求較高，比較建議懸液活率在 85% 以上，同時(shí)用臺(tái)盼藍(lán)、AO/PI 雙染鑒定，并用顯微鏡仔細(xì)觀察細(xì)胞真實(shí)活率、紅細(xì)胞比例（紅細(xì)胞在光鏡下，可以觀察到圓餅狀的亮圈，中間有黑色小點(diǎn)，有經(jīng)驗(yàn)的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)員可以通過(guò)肉眼觀察判斷出來(lái)，而不少品牌的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀有可能會(huì)把紅細(xì)胞計(jì)算為碎片，甚至檢測(cè)不到）。

另外，現(xiàn)階段二代單細(xì)胞測(cè)序，單個(gè)樣品的數(shù)據(jù)量大多為 100G，可以容納 5000-8000 左右的細(xì)胞捕獲量；而三代測(cè)序成本較高，站在節(jié)省經(jīng)費(fèi)的角度，建議一方面準(zhǔn)確的對(duì)細(xì)胞懸液的濃度進(jìn)行測(cè)定（不可單純依靠細(xì)胞計(jì)數(shù)儀），來(lái)控制上機(jī)細(xì)胞總數(shù)（建議上機(jī)不超過(guò) 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞）；同時(shí)也要結(jié)合不同品牌單細(xì)胞捕獲設(shè)備的真實(shí)捕獲率（這點(diǎn)最好找成熟單細(xì)胞科研服務(wù)公司來(lái)完成）來(lái)進(jìn)行綜合判定（建議捕獲不超 5000 個(gè)細(xì)胞如果超過(guò) 5000 需要增加三代測(cè)序數(shù)據(jù)量）。

三、文庫(kù)制備

單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序，只需要一次捕獲，拿到一鏈 CDNA 之后要立刻進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增，如下圖：

? 因此，就需要將已擴(kuò)增好的 cDNA 全長(zhǎng)進(jìn)行質(zhì)控：

如上圖，cDNA 條帶主峰在 1 -1.5kb 左右，下一步可以聯(lián)系三代測(cè)序工廠寄送樣品，由他們進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。但是，也要測(cè)序工廠及時(shí)反饋三代文庫(kù)的質(zhì)檢圖片，要求文庫(kù)主峰與 cDNA 條帶主峰一致，方可進(jìn)行正式的 Nanopore 上機(jī)測(cè)序?qū)嶒?yàn)。

四、單細(xì)胞測(cè)序剩余樣本用于新的科研發(fā)現(xiàn)：

由于現(xiàn)階段三代全長(zhǎng)測(cè)序的準(zhǔn)確性不夠高，考慮到后續(xù)驗(yàn)證工作，比較建議在單細(xì)胞上機(jī)之后，將剩余的細(xì)胞樣品進(jìn)行凍存，從 DNA、RNA、蛋白三個(gè)層面開展后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：

1、DNA 水平：

在我們前期測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，三代原始數(shù)據(jù)中基因單核苷酸結(jié)構(gòu)變異 SNV(RNA 層面的 SNP、Indel)? 較多，為了拿到準(zhǔn)確的，與 DNA 層面一致的突變信息，就需要結(jié)合 DNA 層面的檢測(cè)來(lái)共同篩選核心突變。有兩種做法：

第一，同時(shí)將腫瘤患者的外周血和單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)剩下的腫瘤細(xì)胞做全外顯子測(cè)序（兩個(gè)樣品的市場(chǎng)價(jià)合計(jì)不超 5000 元），通過(guò) ? 腫瘤組織測(cè)出來(lái)的突變 ? 扣掉 ? 自身 PBMC? 的胚系突變，可以得到體細(xì)胞突變，將這些突變 ? 基因位點(diǎn)作為核心突變，利用自動(dòng)化腳本，提取 ? 三代數(shù)據(jù)中的原始 reads，這些 reads 都帶有的 ?Cell?barcode 信息可以定位到突變所在的細(xì)胞與亞群！即可通過(guò)擬時(shí)序算法分析突變細(xì)胞 vs 非突變細(xì)胞的發(fā)育分化軌跡。

第二：做全基因組重測(cè)序（可以根據(jù)具體課題決定是否還需收集 PBMC），發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)變異 CNV，以及融合基因信息，將這些信息與三代全長(zhǎng)進(jìn)行聯(lián)合分析。后續(xù)分析內(nèi)容也極為豐富，可以展開多個(gè)科研角度的解釋。

2、RNA 水平：

在三代全長(zhǎng)拿到特征性轉(zhuǎn)錄本之后，還需要做后續(xù)驗(yàn)證，如果序列較少，可以通過(guò) 5'RACE、3'RACE 實(shí)驗(yàn)拉全長(zhǎng)獲得準(zhǔn)確序列；如果候選轉(zhuǎn)錄本序列較多，也可以通過(guò) Pacbio 直接做 ?Bulk? 測(cè)序（可以混樣測(cè)一份即可，目的是拿到序列），再結(jié)合單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的特異性表達(dá)規(guī)律，可以快速、低成本獲得這些序列的完整信息，下一步即可通過(guò)構(gòu)建動(dòng)物模型，開展功能驗(yàn)證工作。

3、蛋白層面：

現(xiàn)階段的單細(xì)胞測(cè)序大多是以基因作為靶點(diǎn)，但是從已經(jīng)發(fā)表的上萬(wàn)篇單細(xì)胞數(shù)據(jù)中，也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)特異性并不強(qiáng)，這個(gè)是現(xiàn)階段單細(xì)胞測(cè)序需要升級(jí)改進(jìn)的核心關(guān)鍵點(diǎn)。而在真實(shí)組織中，基因在不同亞群中使用不同的轉(zhuǎn)錄本編碼多種蛋白產(chǎn)物。有了單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本技術(shù)，也就意味著可以將靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)從基因細(xì)化為轉(zhuǎn)錄本，挖掘轉(zhuǎn)錄本的蛋白編碼產(chǎn)物。因此，臨床轉(zhuǎn)化最核心的一步：膜蛋白層面，可以依靠全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本獲得一些全新的發(fā)現(xiàn)。

現(xiàn)有的蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)無(wú)法做到 ? 針對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行廣泛的蛋白質(zhì)檢測(cè)，但是蛋白質(zhì)的編碼序列都是從 RNA 層面的轉(zhuǎn)錄本翻譯過(guò)來(lái)，轉(zhuǎn)錄本序列的檢測(cè)比蛋白質(zhì)的檢測(cè)要容易很多。所以，這個(gè)里面就依托一套簡(jiǎn)單的邏輯：從 DNA 到 RNA 到蛋白的中心法則，即可做到通過(guò)單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序，發(fā)現(xiàn)亞群特異性轉(zhuǎn)錄本，再將轉(zhuǎn)錄本序列預(yù)測(cè)的多肽產(chǎn)物與蛋白質(zhì)譜打出來(lái)的多肽產(chǎn)物進(jìn)行匹配，發(fā)現(xiàn)一條潛在的轉(zhuǎn)錄本 + 編碼產(chǎn)物，即為一條新型潛在靶點(diǎn)。其實(shí)，在腫瘤新抗原發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域，這套序列預(yù)測(cè) + 質(zhì)譜檢測(cè)的策略已經(jīng)非常成熟并目較為實(shí)用，因此，可以基干中心法則將這套成熟策略轉(zhuǎn)用到單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)新型蛋白編碼產(chǎn)物領(lǐng)域。

總結(jié)

綜上所述，單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本更適合做新鮮樣品，整體實(shí)驗(yàn)過(guò)程并不復(fù)雜，基本上現(xiàn)階段單細(xì)胞科技服務(wù)類公司都能實(shí)現(xiàn)，只需要在幾個(gè)細(xì)節(jié)上稍加注意即可。

總結(jié)下來(lái)，單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序的本質(zhì)只是對(duì)轉(zhuǎn)錄本加了 ? 細(xì)胞亞群 ? 的標(biāo)簽，方便從數(shù)萬(wàn)條轉(zhuǎn)錄本快速篩選到特異性表達(dá)的少數(shù)轉(zhuǎn)錄本。這個(gè)并不是一套全新開發(fā)的技術(shù)，只能算是從 DNA 到 RNA 到蛋白的一整套符合中心法則的單細(xì)胞多組學(xué)的技術(shù)方案。在我們前期拜訪前沿課題組的過(guò)程中，有不少研究員曾想過(guò)這樣的方法，只是行業(yè)內(nèi)缺乏前人嘗試，我們深入思者過(guò)這些細(xì)節(jié)后，發(fā)現(xiàn)這套方案從樣品的選擇，測(cè)序?qū)嶒?yàn)，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)，均比現(xiàn)階段的單細(xì)胞二代測(cè)序更加實(shí)用，更加貼近臨床轉(zhuǎn)化。從另外一個(gè)角度，轉(zhuǎn)錄本是基因功能實(shí)現(xiàn)的最小細(xì)分單位，針對(duì)轉(zhuǎn)錄本研究的單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序，算得上是轉(zhuǎn)錄組研究領(lǐng)域的終點(diǎn)站。

解析某腫瘤樣本單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)

一、基礎(chǔ)質(zhì)控

詳細(xì)統(tǒng)計(jì)如下，實(shí)測(cè)基因是指在三代全長(zhǎng)中測(cè)到的基因：

以膜蛋白為例，數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的人總膜蛋白有 5520 個(gè)，對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄本有 49893 條；在該樣品中測(cè)到了 1906 個(gè)（大部分膜蛋白不一定會(huì)在該腫瘤中表達(dá)），對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄本是 7739，其中與 Ensemble 完全匹配的轉(zhuǎn)錄本有 5401 條，新轉(zhuǎn)錄本 2338 條，意味著平均每個(gè)膜蛋白會(huì)表達(dá) 1 條新轉(zhuǎn)錄本。從總體統(tǒng)計(jì)來(lái)看，功能基因（膜蛋白、分泌蛋白、轉(zhuǎn)錄因子）會(huì)約 30% 的新轉(zhuǎn)錄本，IncRNA 由于目前數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的并不多，所以有約 50% 的新 IncRNA。

二、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的可靠性：

如同二代單細(xì)胞測(cè)序一樣，三代全長(zhǎng)測(cè)序同樣會(huì)統(tǒng)計(jì)每條轉(zhuǎn)錄本在該樣品中測(cè)到的總 count 數(shù)，截圖如下：

目前已經(jīng)發(fā)表的 SCI 文章，轉(zhuǎn)錄本 total?count>5 即可納入正常聚類分析，經(jīng)過(guò)實(shí)測(cè)建，議設(shè)置轉(zhuǎn)錄本 total?count>20（約占總轉(zhuǎn)錄本的 80%），作為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠候選。

三、轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的特異性

單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序的一大核心應(yīng)用，是發(fā)現(xiàn)亞群的特征性轉(zhuǎn)錄本。單細(xì)胞二代 + 三代的合并聚類、注釋如下：

總計(jì)分 B ?cels、T?cels、Monocyte?cells、Epithelial?cells 四大群。更精細(xì)的注釋，如 Memory?B、Treg、Naive?T、ExhaustT、Mac 等我們會(huì)在后續(xù)章 節(jié)陸續(xù)展開討論。

以 CART 治療領(lǐng)域的某明星分子 MUC1 為例，二代測(cè)序基因表達(dá)情況如下如下：

不過(guò)，該基因在三代全長(zhǎng)測(cè)序中，并未測(cè)到該基因的轉(zhuǎn)錄本，下文有對(duì)此類現(xiàn)象的討論。

另外一個(gè)明星癌基因 MUC2 的表達(dá)展示：

在三代全長(zhǎng)數(shù)據(jù)中，MUC2 測(cè)到了多條 Ensemble 數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄的全新轉(zhuǎn)錄本：

經(jīng)過(guò)后續(xù)的序列比對(duì)（如下圖紅色區(qū)域），發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本是已知轉(zhuǎn)錄本的一部分序列。

示例圖如下：

此外，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本可以測(cè)到較多 lncRNA，下圖為 B 細(xì)胞中某條表達(dá)特異性 lncRNA：

綜合評(píng)價(jià)：

目前單細(xì)胞二代測(cè)序?qū)蜻M(jìn)行表達(dá)定量的原理，是把該基因表達(dá)出來(lái)的所有轉(zhuǎn)錄本的 UM 進(jìn)行求和，而三代測(cè)序是每條轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行單獨(dú)計(jì)數(shù)，如某個(gè)基因在在細(xì)胞的 count 值是 100，理論上來(lái)說(shuō)，在三代轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)中，可以對(duì)應(yīng)找到 100 條轉(zhuǎn)錄本 UM1。不過(guò)，就實(shí)際情況來(lái)說(shuō)，最終的數(shù)據(jù)產(chǎn)出都是依靠測(cè)序技術(shù)，現(xiàn)階段的三代測(cè)序成本仍然較高，如果以比較高的投入來(lái)測(cè)非常多的三代數(shù)據(jù)是不太現(xiàn)實(shí)的。也就是說(shuō)，只能在成本與高期望之間，選擇一個(gè)比較適中的平衡。因此，是否選擇使用單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，有如下幾個(gè)建議：

1、傳統(tǒng)的 Bulk-seq 研究中，借助 illumina、MGISEQ、Pacbio、Nanopore 等二代、三代測(cè)序技術(shù)同樣可以測(cè)到較多的可變剪切、融合基因、新轉(zhuǎn)錄本等。唯一讓研究者困擾的是測(cè)到的新序列太多（2000+)，較難篩選過(guò)濾做后期功能驗(yàn)證。單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，是對(duì)新測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本加上 ? 細(xì)胞亞群 ? 的標(biāo)簽，可以比較快速的篩選，如腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞亞群中的特異性新轉(zhuǎn)錄本，節(jié)省下游驗(yàn)證成本。這類課題是比較適合單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序，最終結(jié)合實(shí)際數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)特異性轉(zhuǎn)錄本。

2、如果已經(jīng)指定了某個(gè)關(guān)鍵基因，想研究該基因是否在特定亞群中存在可變剪切或新轉(zhuǎn)錄本、融合基因等，比較建議先從已發(fā)表文章，或者公開數(shù)據(jù)庫(kù)（如 htps:/singlecell.broadinstitute.ore/single_cell) 中，預(yù)先査詢?cè)摶虻膯渭?xì)胞表達(dá)豐度。如果該基因表達(dá)量較低，并且亞群（如 T 細(xì)胞）的表達(dá)比例低于 50%，則要慎重選擇單細(xì)胞全長(zhǎng)測(cè)序方法。解決方法是可以把這群細(xì)胞通過(guò)流式、磁珠等技術(shù)分選出來(lái)（人為富集），單獨(dú)對(duì)這群細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞二代 + 三代測(cè)序。

3、從上述的 MUC1 未檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本，而 MUC2 檢測(cè)到多條新轉(zhuǎn)錄本的例子來(lái)看，在現(xiàn)階段較低測(cè)序投入情況下，三代全長(zhǎng)技術(shù)更傾向于測(cè)出來(lái)高豐度的轉(zhuǎn)錄本。從另外一個(gè)角度來(lái)說(shuō)，如果某條轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)在三代全長(zhǎng)的表達(dá)矩陣中，也就意味著該轉(zhuǎn)錄本在真實(shí)細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)豐度仍然較高。這種方式相當(dāng)于過(guò)濾掉了低豐度的轉(zhuǎn)錄本，這個(gè)對(duì)于 siRNA 干擾、膜蛋白、lncRNA 項(xiàng)目來(lái)說(shuō)算是增加了個(gè)較為可信的屬性。另外，如果一定要看 MUC1 基因的轉(zhuǎn)錄本，其實(shí)可以通過(guò) IGV 導(dǎo)入二代測(cè)序的 BAM 文件，直接查看該基因的原始測(cè)序序列，可以在一定程度上通過(guò)已經(jīng)測(cè)到的這些 reads 來(lái)探索該 reads 分屬于哪條轉(zhuǎn)錄本（如果該基因存在多種轉(zhuǎn)錄本的話）。

4、單細(xì)胞三代全長(zhǎng)可以直接給出來(lái)每條新轉(zhuǎn)錄本的序列，不過(guò)測(cè)序錯(cuò)誤的情況也時(shí)常發(fā)生，所以后期驗(yàn)證必不可少。

1、高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)格按 ISO9001:2015 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行；

2、標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)控：豐富的實(shí)操經(jīng)驗(yàn)構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)控體系；

3、流程化分析：完善的分析流程，準(zhǔn)確快速解析單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)；

4、專業(yè)的團(tuán)隊(duì)：專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)具有多年項(xiàng)目方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、售后分析等經(jīng)驗(yàn)；

5、全流程服務(wù)：提供樣本處理、建庫(kù)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析的全套服務(wù)。

伯豪生物提供：?jiǎn)渭?xì)胞核測(cè)序、單細(xì)胞核測(cè)序技術(shù)服務(wù)

• 樣本類型： 新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。
• 樣本來(lái)源： 血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。
• 樣本量及其它質(zhì)控要求：

（1）細(xì)胞懸液：>10* 目標(biāo)細(xì)胞個(gè)數(shù)（最少 10,000 個(gè)細(xì)胞）；活率 >85%；濃度 500-1,000 個(gè)細(xì)胞 / ul；細(xì)胞間無(wú)粘連（成團(tuán)率 <5%）；無(wú)大于 40um 的細(xì)胞碎片或其它顆粒物；不存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑和非細(xì)胞的核酸分子。

（2）血液：EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。

（3）組織：0.3 cm × 0.3 cm（不超過(guò) 0.5cm ×? 0.5cm）的新鮮組織，4～5 塊。

• 樣本保存運(yùn)輸：

（1）細(xì)胞懸液：最好現(xiàn)場(chǎng)制備，如要運(yùn)輸，建議使用細(xì)胞保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。

（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運(yùn)輸，4 小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運(yùn)輸。

（3）組織：建議使用單細(xì)胞專用的組織保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。

• 捕獲細(xì)胞數(shù)及測(cè)序數(shù)據(jù)量：