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人類基因組測序開展的數(shù)十年以來，研究人員建立了遺傳因素與許多 Jí 病之間的聯(lián)系。但是，編碼 基因組 DNA 的核苷酸只是遺傳因素中影響細胞功能和整體健康的一部分，表觀遺傳學(xué)（指在某些情況下 不修改 DNA 序列而發(fā)生的可遺傳的改變）也具有重要功能。DNA 甲基化是一種已經(jīng)過大量研究的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，其可化學(xué)修飾胞嘧啶和腺嘌呤。胞嘧啶甲基化常發(fā)生在基因組中的 CG 序列，稱為 CpG 位點，它以細胞特異性的方式廣泛地調(diào)控基因表達。全基因組關(guān)聯(lián)研究 (GWAS) 將 DNA 甲基化的改變與復(fù)雜病例如癌癥和肥胖以及復(fù)雜的生物學(xué)狀態(tài)例如衰老和發(fā)育聯(lián)系起來 [1,2]。近年來甲基化測序已擴展到基因表達之外，開始在 Jí 病診斷中獲得關(guān)注 [1,3-5]。近期研究表明差異甲基化是癌癥檢 Cè 中信息豐富且 靈敏的標(biāo)記，不論甲基化是否與基因表達相關(guān) [6]。
目前，DNA 甲基化在癌癥液體活檢（如 cfDNA）中已經(jīng)有很多相關(guān)研究，并受到越來越多的關(guān)注。常 見的 DNA 甲基化研究手段都是基于亞硫酸氫鹽（化學(xué)試劑）的轉(zhuǎn)化，這種方法很劇烈，對 DNA 損傷嚴(yán)重，對 DNA 起始量有著較高要求。而血液 cfDNA 的含量通常很低，只有幾十 ng，普通的亞硫酸氫鹽測序手段很難滿足。因此伯豪生物引進 EM-seq（Enzymatic methyl sequencing），該技術(shù)基于酶學(xué)溫和轉(zhuǎn)化，可實 現(xiàn) DNA 甲基化位點的單堿基分辨率，適用于癌癥早篩液體活檢樣本的標(biāo)志物研究（如：血漿 cfDNA，尿液 cfDNA，腦脊液 cfDNA 等）也適用于研究細胞分化的單個細胞超微量樣本（如：卵母細胞，精母細胞，胚胎等）。EM-seq 提供了穩(wěn)健的全流程完整解決方案，用于識別人類基因組中的甲基化區(qū)域。文庫制備過程 中，采用獨特的酶促轉(zhuǎn)化，它對脫氧核糖核酸（DNA) 的損害小得多，需要的樣本輸入更少，從而獲得更高 質(zhì)量、性能更好的文庫。Twist 自定義甲基化探針組合設(shè)計為 CpG 檢 Cè 提供了有效特別的探針，用于靶向富集。優(yōu)化的雜交試劑增加了工作流程的時間靈活性，并提高了中靶率。甲基化測序涉及酶或化學(xué)方法，這些方法可使未甲基化的胞嘧啶通過一系列反應(yīng)，通過脫氨基 轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則 保持完整（圖 1）。在擴增過程中，尿嘧啶對應(yīng)的互補鏈上會互補配對加上腺嘌呤，造成未甲基化的胞嘧啶的原始位置引入胸腺嘧啶。如圖所示序列終產(chǎn)物是不對稱的，轉(zhuǎn)化后形 成兩條不同的雙鏈 DNA 分子（圖上）；對于甲基化的 DNA，同樣的過程則產(chǎn)生另外不同序列（圖下）。
▲圖 1
產(chǎn)品優(yōu)勢
1、酶轉(zhuǎn)化 Zuì大限度降低 DNA 損壞，超低 DNA 起始量要求，低至 10ng；
2、卓越的比對率，GC 均一性；
3、高靈敏度，分辨率可達到單個堿基；
4、相比亞硫酸氫鹽方法檢 Cè 可多檢 Cè 15% 的甲基化位點；
5、靈活適用不同靶向區(qū)域。
目錄化產(chǎn)品
人（hg38）的 134Mb 設(shè)計長度（覆蓋約 400 萬 CpG 位點），基于新的 UCSC, Ensembl, ENCODE 等新的數(shù)據(jù)庫，關(guān)注那些已知甲基化可影響基因調(diào)節(jié)的區(qū)域：57% CpG open seas (interCGI), 21% CpG island shores, 15% CpG islands, 8% CpG island shelves。
▲圖。EM-seq 轉(zhuǎn)化涉及一系列酶反應(yīng)，以識別未甲基化胞嘧啶。
在 Dì 一次反應(yīng)期 間，10-11 易位雙加氧酶 2(TET2) 將甲基 化胞嘧啶（5mC 和 5hmC）轉(zhuǎn)化為 5 - 羧基 胞嘧啶（5caC) 以及氧化增強劑葡糖苷 酸 5hmC(5ghmC)。這些反應(yīng)保護 5mC 和 5hmC 免受下游脫氨作用。然后，在 APOBEC 將胞嘧啶脫氨至尿嘧啶之前， 使 DNA 變性。隨后的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 擴增將修飾的 5mC 或 5hmC 轉(zhuǎn)化 為胞嘧啶，并將尿嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。PCR 后，核酸序列與重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的 序列一致，使得 EM-seq 與現(xiàn)有分析流程 （如 Bismark 和 bwa-meth）相兼容。
酶法的高效轉(zhuǎn)化
| 指標(biāo) | 末甲基化 Lambda DNA | CpG 甲基化 pUC19 DNA |
| 預(yù)期轉(zhuǎn)化效率 | ≥99.5% | ≥99.5% |
| 實測轉(zhuǎn)化效率 | 99.77% | 99.57% |
| 預(yù)期 CpG 甲基化水平 | 約 0.5% | 95-98% |
| 實測 CpG 甲基化水平 | 0.22228% | 95.7572% |
在 EM-seq 和 BS-seq 中，酶和亞硫酸氫鹽都是將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，且轉(zhuǎn)化效率接近。選擇 CpG 甲基化的 pUC19 DNA 和未甲基化的 Lambda DNA 這種已知甲基化 DNA 作為質(zhì)控對象，結(jié)果顯示，兩種文庫轉(zhuǎn)換方法的轉(zhuǎn)化率均達到 99.5%，以胞嘧啶在非 CpG 位點轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶的百分比來測量。
1、Jones PA. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond. Nat Rev Genet 2012; 13: 484-492.
2、Yang X, Shao X, Gao L, Zhang S. Comparative DNA methylation analysis to decipher common and cell type-specifific patterns among multiple cell types. Brief Funct Genomics 2016; 15: 399-407.
3、Loh M, Zhou L, Ng HK, Chambers JC. Epigenetic disturbances in obesity and diabetes: Epidemiological and functional insights. Mol Metab 2019; 27S: S33-S41.
4、Ferrucci L, Gonzalez-Freire M, Fabbri E et al. Measuring biological aging in humans: A quest. Aging Cell 2020; 19: e13080.
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6、Locke WJ, Guanzon D, Ma C et al. DNA Methylation Cancer Biomarkers: Translation to the Clinic. Front Genet 2019; 10: 1150.
7、Liu MC, Oxnard GR, Klein EA et al. Sensitive and specifific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Ann Oncol2020; 21: 745-759.
8、Vaisvila R, Ponnaluri VKC, Sun Z et al. Enzymatic methyl sequencing detects DNA methylation at single-base resolution from picograms of DNA. Genome Res 2021.
