全外顯子組測(cè)序（Whole Exome Sequencing，WES）是對(duì)整個(gè)基因組的全部基因編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序。人類基因組大小約 3G 個(gè)堿基，而基因編碼區(qū)只占 1 -2%，大約 30M 個(gè)堿基。而編碼區(qū)出現(xiàn)的變異往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，是大多數(shù)遺傳病或腫瘤發(fā)生的直接原因。因此，對(duì)外顯子區(qū)域進(jìn)行測(cè)序是經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。

全外顯子組測(cè)序利用 Agilent SureSelect 捕獲探針雜交富集外顯子區(qū)域的 DNA 序列，結(jié)合高通量測(cè)序，可以發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)域相關(guān)變異信息。

Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)

發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)域的突變，尋找突變與遺傳病、復(fù)雜疾病、腫瘤等疾病的關(guān)系。

作為 Agilent 公司的認(rèn)證服務(wù)商，伯豪采用穩(wěn)定的 SureSelect 捕獲系統(tǒng)進(jìn)行全外顯子組捕獲；

伯豪樣本中心具有十年特殊樣本處理經(jīng)驗(yàn)，針對(duì) FFPE、特殊腫瘤等樣品有豐富經(jīng)驗(yàn)；

具有豐富的遺傳病和腫瘤隊(duì)列研究經(jīng)驗(yàn)，幫助客戶發(fā)表多篇高分文章；

專業(yè)報(bào)告解讀系統(tǒng)，對(duì)臨床應(yīng)用支持良好。

樣本類型：DNA、組織、細(xì)胞、全血等；

DNA 總量：DNA≥ 2 μg；濃度：DNA≥ 50 ng/μl；要求主帶清晰，無(wú)降解，濃度大于 50ng/ul，總量大于 1ug，OD260/OD280 =1.8~2.0，OD260/OD230=1.5 ~2.2。

測(cè)序深度：≥100X；

測(cè)序讀長(zhǎng)：2*150bp。

數(shù)據(jù)分析內(nèi)容

案例一【伯豪文獻(xiàn)】全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)急性紅細(xì)胞白血病新突變

急性紅細(xì)胞白血病（AEL）是白血病（AML）亞型中的一種，在老年人白血病中的占比較高。相對(duì)于其他類型的 AML，AEL 病人有更加 poor-risk 的細(xì)胞遺傳學(xué)異常和不良的預(yù)后。雖然針對(duì) AEL 的外顯子突變位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)已有一些報(bào)道。但是，針對(duì) AEL 的完整突變譜發(fā)現(xiàn)還沒有相關(guān)報(bào)道。研究人員運(yùn)用外顯子組測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了 AML 相關(guān)的高頻突變基因 GATA2 和 CEBPA 等突變，為理解急性紅細(xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展過程提供了新的證據(jù)。

本研究通過外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了 AEL 相關(guān)的特異性體細(xì)胞突變。其中，對(duì) GATA2 的大樣本驗(yàn)證及不同類型白血病樣本驗(yàn)證，表明其實(shí) AEL 所特有的高頻突變。此外，通過突變轉(zhuǎn)染的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明，GATA2 的突變影響力紅細(xì)胞的發(fā)育過程。該研究為理解急性紅細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制提供了新的證據(jù)。

AEL 中的突變【a】58 個(gè) AEL 病人的突變分布圖；【b】GATA2 蛋白的結(jié)構(gòu)；【c】GATA2 突變?cè)?AML, CML-BC, MDS 及 ALL. 中的患病率。

Ping N, Sun A, Song Y,et al. Exome sequencing identifies highly recurrent somatic GATA2 and CEBPA mutations in acute erythroid leukemia. Leukemia. 2016.

案例二：【伯豪文獻(xiàn)】全基因組連鎖分析和外顯子測(cè)序在非綜合征耳聾家系中鑒定 DMXL2 致病變異

目前已知有超過 100 多個(gè)基因，其所含的致病變異會(huì)對(duì)聽覺系統(tǒng)造成不同的功能影響，并引起相應(yīng)的聽力損失。但對(duì)非綜合征耳聾而言，依舊有超過 50 多相關(guān)位點(diǎn)的遺傳致病機(jī)制還未詳細(xì)闡明。本文利用全基因組 SNP 芯片及全外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)一非綜合征耳聾家系中的 21 個(gè)樣本進(jìn)行全基因組連鎖分析，并通過對(duì)個(gè)別家系樣本進(jìn)行全外顯子組測(cè)序和對(duì)所有家系樣本進(jìn)行 Sanger 測(cè)序來(lái)鑒定候選的致病變異。

全基因組連鎖分析在家系中的 10 個(gè) case 及 11 個(gè) control 中進(jìn)行（圖 1a），分析得到 9.68Mb 的致病候選區(qū)段，LOD 值為 4.03（圖 1c）。該區(qū)段中未發(fā)現(xiàn)與綜合征或非綜合征耳聾相關(guān)的已知致病基因，因此，該家系聽力喪失的癥狀可能是由一個(gè)新基因變異造成。文章隨后對(duì)家系中三個(gè)患病個(gè)體及一個(gè)正常對(duì)照個(gè)體進(jìn)行了全外顯組測(cè)序（平均測(cè)序深度 >100X）。候選變異需為編碼區(qū)的無(wú)義變異、錯(cuò)義變異，位于可變剪切位點(diǎn)的變異和 InDel 變異，以及人群數(shù)據(jù)庫(kù)中變異頻率小于 0.001 的變異等，分析得到 3 個(gè)候選致病變異。研究人員對(duì)家系所有 22 個(gè)樣本，尤其是對(duì) II- 2 樣本進(jìn)行 sanger 測(cè)序，鑒定出一個(gè)在家系個(gè)體中呈現(xiàn)共分離的變異位點(diǎn) DMXL2: NM_001174116:exon29:c.7250G>A:p.Arg2417His（圖 2）。后期的小鼠功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) DMXL2 基因可能對(duì)內(nèi)耳功能有重要作用（圖 3）。

▲圖 1【a】患有常染色體顯性的非綜合征聽力喪失家系圖譜。箭頭所指為先證者，星號(hào)標(biāo)記的個(gè)體參與了 SNP 芯片連鎖分析，三角標(biāo)記個(gè)體（II-1，IV-1，IV-4，IV-6）則后續(xù)用來(lái)進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，下劃線標(biāo)記個(gè)體 II-2，則包含了一個(gè)關(guān)鍵的重組事件。 【c】15 號(hào)染色體連鎖分析的 LOD 值，當(dāng)把 II- 2 個(gè)體包括后，其大的 LOD 值達(dá)到了 4.33。

▲圖 2【a】變異和參考序列的色譜圖。【b】DMXL2 的 Arg2417 殘基在 Homo sapiens, Mus musculus, Bos taurus, Canis lupus, Gallus gallus 和 Danio rerio 中具有保守性。【c】DMXL2 蛋白的功能域和 p.Arg2417His 變異的位置。

▲圖 3  小鼠耳蝸中 Dmxl2 的表達(dá)情況?！綼】RT-PCR 檢測(cè)從 P1 小鼠耳蝸提取總 RNA 的 Dmxl2 表達(dá)情況。小鼠尾巴的基因組 DNA 作為陰性對(duì)照?！綽】免疫染色實(shí)驗(yàn)表明 DMXL2 在小鼠柯蒂氏器官的螺旋神經(jīng)節(jié)中有表達(dá)?！綾】免疫染色實(shí)驗(yàn)表明 DMXL2 在小鼠的毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)纖維細(xì)絲中有表達(dá)。

Chen, D.Y., et al., A dominant variant in DMXL2 is linked to nonsyndromic hearing loss. Genet Med, 2016.

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