盡管轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)獲得很多令人激動(dòng)的進(jìn)展，但它終歸還是一個(gè)高度協(xié)調(diào)的、受表觀基因組調(diào)控的基因表達(dá)程序的副產(chǎn)物。表觀基因組是由 DNA 的染色質(zhì)狀態(tài)決定的，這種狀態(tài)可以是開放的（可及的），也可以是封閉的（不可及的）。染色質(zhì)狀態(tài)影響了 DNA 結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子或 RNA 聚合酶）如何與基因組 DNA 相互作用，這意味著表觀基因組調(diào)控不僅可以影響發(fā)育方向、疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)，還往往發(fā)生在轉(zhuǎn)錄變化之前，并可用來揭示其他方法難以區(qū)分的細(xì)胞類型。

研究人員已經(jīng)利用單細(xì)胞 ATAC（轉(zhuǎn)座酶可及性染色質(zhì)分析）來鑒定樣本中的調(diào)控元件。如今為了更深入的了解細(xì)胞身份，許多研究人員正在嘗試獲取一種綜合細(xì)胞開放染色質(zhì)圖譜和基因表達(dá)譜的統(tǒng)一視圖。有些研究人員將樣本一分為二，用單細(xì)胞 RNA-seq 處理一半樣本，用單細(xì)胞 ATAC-seq 處理另一半樣本，從而同時(shí)獲得轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組信息。然后，他們據(jù)此推斷哪些類型的細(xì)胞在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中相互對應(yīng)。然而，這種方法在很大程度上依賴于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、啟動(dòng)子位置和基因表達(dá)水平之間關(guān)系的假設(shè)，以及有關(guān)不同類型細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)特征的先驗(yàn)信息。此外，處理兩份樣本的不同流程之間的差異也可能會影響細(xì)胞狀態(tài)和結(jié)果。設(shè)想一下另一種選擇，您可以在同一時(shí)間分析同一個(gè)細(xì)胞中的這兩種模式。不需要推斷，不需要等待生物信息學(xué)家來對配對結(jié)果進(jìn)行分析，即使在細(xì)胞數(shù)量很少時(shí)，也不需要反復(fù)糾結(jié)應(yīng)該優(yōu)先采用哪種檢測。

全新的 Chromium 單細(xì)胞多組學(xué) ATAC +  基因表達(dá)，就能夠?qū)崿F(xiàn)這一點(diǎn)。該產(chǎn)品可同時(shí)捕獲同一單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組，為您提供所需的、足夠深入的信息去鑒定基因表達(dá)模式、細(xì)胞類型，以及細(xì)胞狀態(tài)是如何建立的。您能夠?qū)颖具M(jìn)行更加深入、高置信度地分析，從而借助關(guān)鍵的基因表達(dá)標(biāo)志物，您可以發(fā)現(xiàn)新的基因調(diào)控相互作用，或更好地解釋表觀遺傳特征。

讓我們想象一種場景，假設(shè)一名癌癥研究人員想了解治療耐藥性背后的機(jī)制。分別對有應(yīng)答和無應(yīng)答患者樣本的相同細(xì)胞進(jìn)行 mRNA 表達(dá)和染色質(zhì)景觀圖譜分析，他們能夠鑒定腫瘤特異性的轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵調(diào)控元件的激活，然后通過相關(guān)的基因表達(dá)變化將它們與下游目標(biāo)基因關(guān)聯(lián)起來。這些信息將有助于闡明引起耐藥性的癌細(xì)胞特異性的基因調(diào)控程序和基因表達(dá)特征。當(dāng)然，這僅僅是一個(gè)使用案例。讓我們再深入思考一下：單細(xì)胞多組學(xué) ATAC +  基因表達(dá)如何揭示驅(qū)動(dòng)免疫細(xì)胞譜系分化的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，又如何鑒定與神經(jīng)退行性疾病和精神疾病相關(guān)的目標(biāo)基因和細(xì)胞類型？它可以為您帶來哪些更深入的見解？

那么，該實(shí)驗(yàn)是如何運(yùn)行的？

為了了解這種雙重處理如何進(jìn)行，我們采訪了兩名參與開發(fā)單細(xì)胞多組學(xué) ATAC +  基因表達(dá)的 10x Genomics 研發(fā)科學(xué)家：研究員 Kamila Belhocine 和資深計(jì)算生物學(xué)家 Shamoni Maheshwari。

我們了解到，Chromium 單細(xì)胞多組學(xué) ATAC +  基因表達(dá)是從單細(xì)胞核懸液開始的。用轉(zhuǎn)座酶對大量細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)座，這種酶優(yōu)先切割開放染色質(zhì)區(qū)域中的核 DNA。然后將轉(zhuǎn)座后的細(xì)胞核分成液滴，也稱為 GEM，其中單個(gè)凝膠珠（Gel Bead）含有的 10x 條形碼。在 GEM 內(nèi)，條形碼與單個(gè)細(xì)胞核內(nèi)的 mRNA 和轉(zhuǎn)座 DNA 片段相連接。孵育后，溶解 GEM 并混合，然后進(jìn)行純化、預(yù)擴(kuò)增和文庫構(gòu)建?；旌虾蟮?GEM 制備出兩個(gè)文庫，一個(gè)用于 RNA 測序，另一個(gè)用于 ATAC 分析。

單細(xì)胞多組學(xué) ATAC +  基因表達(dá)的流程。通過在簡化的流程中綜合基因表達(dá)和 ATAC-seq 的數(shù)據(jù)，獲得轉(zhuǎn)錄圖譜和染色質(zhì)景觀圖譜的一體化視圖。

在詳細(xì)了解工作流程以及如何實(shí)現(xiàn)此技術(shù)之后，我們進(jìn)一步了解了他們對使用多組學(xué)來解決生物學(xué)問題有何看法。

在開發(fā) Chromium 單細(xì)胞多組學(xué) ATAC +  基因表達(dá)時(shí)，您試圖解決哪些研究問題？

Kamila：近年來，在單細(xì)胞水平測定基因表達(dá)讓科學(xué)家能夠前所未有地深入研究和了解生物學(xué)系統(tǒng)。許多基因表達(dá)的模式受到表觀遺傳程序的調(diào)控，這些程序由染色質(zhì)可及性的變化所編碼，可通過 ATAC-seq 來測定。然而，盡管各個(gè)細(xì)胞狀態(tài)之間的染色質(zhì)可及性差異很明顯，并且很容易被檢測到，但是如果不直接讀出這些表觀遺傳變化對基因表達(dá)的影響，也很難解釋它們。單細(xì)胞多組學(xué) ATAC +  基因表達(dá)是先進(jìn)商業(yè)化的解決方案，能夠高精度闡釋染色質(zhì)可及性與基因表達(dá)之間的相互作用，從而以高分辨率了解健康與疾病狀態(tài)下的基因調(diào)控。

您能介紹一下 Cell Ranger ARC 軟件分析流程的強(qiáng)大功能嗎？

Shamoni：人類基因組計(jì)劃發(fā)現(xiàn)，人類基因組中的 1% 由基因組成。在接下來的十年，DNA 元件百科全書（ENCODE）計(jì)劃確定了近 20% 的人類基因組具有潛在的調(diào)控功能。通過鑒定單細(xì)胞中的開放染色質(zhì)位點(diǎn)和基因表達(dá)，Cell Ranger ARC 軟件能夠在這些潛在調(diào)控區(qū)域與轉(zhuǎn)錄組之間架起橋梁。

與目標(biāo)基因直接關(guān)聯(lián)的推定調(diào)控元件的鑒定。上圖來自我們的 Loupe Browser 可視化軟件，它是單細(xì)胞多組學(xué) ATAC +  基因表達(dá)附帶的數(shù)據(jù)可視化軟件。上半部分您可以看到 LEF1 的整體關(guān)聯(lián)，這些關(guān)聯(lián)表示 1  Mb 窗口內(nèi)與 LEF1 基因表達(dá)正相關(guān)（藍(lán)色弧線）或負(fù)相關(guān)（紅色弧線）的開放染色質(zhì)峰，它是根據(jù) 7,273 個(gè) PBMC 細(xì)胞核的樣本繪制的。下半部分，根據(jù)不同細(xì)胞類型對 LEF1 表達(dá)水平和開放染色質(zhì)峰進(jìn)行彩色標(biāo)注。藍(lán)色框顯示的是基因表達(dá)和開放染色質(zhì)區(qū)域具有正相關(guān)的細(xì)胞類型。紅色框顯示的是基因表達(dá)和開放染色質(zhì)區(qū)域具有負(fù)相關(guān)的細(xì)胞類型。

您們認(rèn)為科學(xué)家現(xiàn)在可以實(shí)現(xiàn)哪些以往不可能的發(fā)現(xiàn)？

Shamoni：各種批量分析，如 ENCODE 所進(jìn)行的分析，已經(jīng)獲得了人類基因組中調(diào)控元件的目錄。如果將我們這種方法進(jìn)一步應(yīng)用在各種不同類型的樣本和細(xì)胞上，研究人員就能夠高精度解析某個(gè)調(diào)控元件在哪些細(xì)胞類型或狀態(tài)中起作用及其目標(biāo)基因的表達(dá)狀態(tài)。

對細(xì)胞進(jìn)行分類，其實(shí)是根據(jù)所觀察到的基因表達(dá)譜的差異來劃定某些意定的邊界，據(jù)此將細(xì)胞劃分入所謂的“細(xì)胞類型”中。但是我們知道，細(xì)胞在體內(nèi)具有一系列連續(xù)的狀態(tài)，其基因表達(dá)是受到多個(gè)表觀遺傳因素控制的結(jié)果。在同一細(xì)胞中同時(shí)進(jìn)行基因表達(dá)和 ATAC 的分析，增加了有關(guān)細(xì)胞中基因表達(dá)程序的推定調(diào)控狀態(tài)的信息，從而能夠區(qū)分動(dòng)態(tài)的細(xì)胞狀態(tài)。

科學(xué)家有望完善對非編碼變異的解釋。GWAS 研究中鑒定出的大多數(shù) SNP 位于非編碼區(qū)。隨之而來的挑戰(zhàn)是解釋這種遺傳變異，并確定其功能靶點(diǎn)。如果非編碼 SNP 落在開放染色質(zhì)峰內(nèi)，則這種分析有能力揭示推定的調(diào)控區(qū)域在特定類型的細(xì)胞中是否具有活性，以及它可能調(diào)控哪些基因。

Kamila：有了單細(xì)胞多組學(xué) ATAC +  基因表達(dá)，科學(xué)家能夠建立健康和疾病狀態(tài)下基因調(diào)控的機(jī)制，更好地了解非編碼區(qū)內(nèi)遺傳破壞的影響，為擴(kuò)展知識庫做出獨(dú)特貢獻(xiàn)，催生出改善人們生活的新型療法。

看到科學(xué)家使用您們參與開發(fā)的產(chǎn)品進(jìn)行探索，感受如何？

Kamila：作為產(chǎn)品開發(fā)人員，我們致力于了解用戶的需求，并據(jù)此開發(fā)產(chǎn)品，以實(shí)實(shí)在在地滿足這些需求。我總是非常驚喜的看到我們產(chǎn)品所帶來的發(fā)現(xiàn)，以及其對疾病和發(fā)育的整體認(rèn)識所產(chǎn)生的影響。我堅(jiān)信，對生物學(xué)的深入理解將改善數(shù)百萬甚至數(shù)億人的健康和生活質(zhì)量，隨著每一篇使用我們開發(fā)產(chǎn)品的文獻(xiàn)發(fā)表，我都認(rèn)為 10x Genomics 為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)做出了有意義的貢獻(xiàn)。

來源 10x Genomics

總之，單細(xì)胞多組學(xué) ATAC +  基因表達(dá)可以：

?  加深對細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)的表征

?  結(jié)合表觀基因組學(xué)和基因表達(dá)分析揭示以前被隱藏的新見解

?  通過一次實(shí)驗(yàn)中的多種讀數(shù)加速對珍貴樣本的研究

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