【雜志名稱】Cell Stem Cell（IF=21.46）

【發(fā)表單位】美國波士頓兒童醫(yī)院，哈佛醫(yī)學(xué)院，波士頓大學(xué)，加州大學(xué)等

【發(fā)表時間】2020-09-04

【主要技術(shù)】10XGenomics

概述：KRAS 突變是上皮癌的常見驅(qū)動因素。然而，尚不清楚在上皮細(xì)胞中致癌性 KRAS 激活后早期發(fā)生的分子變化。研究人員比較了四組樣本中 KRAS 激活后單細(xì)胞分辨率下的轉(zhuǎn)錄變化。除了患者樣品和基因工程小鼠模型外，研究人員還從原代小鼠和人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞衍生的肺上皮細(xì)胞開發(fā)了類器官系統(tǒng)，從而對早期肺腺癌進(jìn)行建模。在所有四種情況下，表達(dá)致癌性 KRAS 的肺泡上皮祖細(xì)胞（AT2）均降低成熟譜系基因的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)證明了體外類器官方法可用于揭示致癌性 KRAS 表達(dá)的早期結(jié)果。該文獻(xiàn)提供大量數(shù)據(jù)集，并描述了能夠區(qū)別早期肺癌中轉(zhuǎn)錄差異的類器官工具，從而有助于尋找 KRAS 驅(qū)動的腫瘤靶標(biāo)。

實驗樣本

主要結(jié)果

一、遠(yuǎn)端肺上皮的 scRNA-Seq 揭示早期腫瘤形成過程中 KRASG12D 激活細(xì)胞的特異 Cluster

圖 1   利用 scRNA-seq 分析體內(nèi) LUAD 早期上皮細(xì)胞群

用 Ad5-CMV-Cre 感染 KY 小鼠，7 周后，用 FACS 收集重組 [YFP+] 和未重組 [YFP-] 細(xì)胞。然后用 10XGenomics scRNA-seq 來檢測肺腺癌（LUAD) 早期的基因表達(dá)。從圖看供分成 4 個亞群，C1 亞群主要由 YFP + 細(xì)胞組成，C0 亞群是有 YFP- 細(xì)胞組成，而 C2 和 C3 中同時存在 YFP + 和 YFP- 細(xì)胞。

AT2 細(xì)胞的 marker 基因 Sftpc 和 Lyz2 在 C0 和 C1 中表達(dá)高，纖毛細(xì)胞的 marker 基因 Foxj1 和 Cd24 在 C2 中表達(dá)高，棒狀細(xì)胞的 marker 基因 Scgb1a1  和 Scgb3a2 在 C3 中表達(dá)高。AT2 細(xì)胞先前被認(rèn)為是肺腺癌細(xì)胞的起源，并且是一種在 KRASG12D 表達(dá)上形成轉(zhuǎn)錄上不同簇的肺上皮細(xì)胞類型。因此，研究者集中研究了 KRAS 激活對 AT2 細(xì)胞的影響。

對 C0 和 C1 兩個亞群的基因、轉(zhuǎn)錄因子（TF) 和輔助因子（TFC) 進(jìn)行差異表達(dá)（DE) 分析。原癌基因 Myc 和 Id1（一種可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的 TF）在 C1 中高表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子（TF) Nkx2- 1 和 AT2 細(xì)胞特征轉(zhuǎn)錄因子  Etw5 在 C0 中高表達(dá)。此外，與配對的癌旁組織相比，NSCLC 腫瘤組織中發(fā)現(xiàn) TF Foxq1 高表達(dá)，肺發(fā)育過程中表達(dá)的 TF Etv4 以及 Klf4 對誘導(dǎo)細(xì)胞的多能性很重要，且在 C1 中高表達(dá)。因此，當(dāng) KRASG12D 表達(dá)時，AT2 細(xì)胞下調(diào) TF/TFCs 維持 AT2 細(xì)胞特征，而已知促進(jìn)腫瘤生長、對發(fā)育過程重要并誘導(dǎo)多能性的因子表達(dá)增加。小鼠 AT2 細(xì)胞 Marker 基因表達(dá)在 C1 中明顯低于 C0。

有報道顯示原代人 LUAD 包含表達(dá)多種譜系特異性特征的細(xì)胞。本研發(fā)現(xiàn) C1 的 AT2 細(xì)胞 markers Sftpc，Lyz2 和 Etv5 的表達(dá)較低，這與 AT2 細(xì)胞特征的丟失一致。值得注意的是，肺泡 1 型（AT1）markers Aqp5 和 Pdpn 以及棒狀細(xì)胞  markers Scgb1a1 和 Scgb3a2 被上調(diào)，表明其他肺上皮細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄啟動作用。此外，小鼠肺干細(xì)胞的 markers Ly6a(SCA1) 和 KrasLSL-G12D/+；p53fl/fl(KP) 肺癌模型中的腫瘤增殖細(xì)胞也在一些 C1 細(xì)胞中上調(diào)。

二、體外類器官可迅速再現(xiàn)體內(nèi)腫瘤進(jìn)展

為了更好地了解 KRASG12D 激活后的轉(zhuǎn)錄程序，研究者開發(fā)了一種體外類器官系統(tǒng)，使他們能夠在致癌的 KRAS 誘導(dǎo)后不久快速模擬原代肺 AT2 細(xì)胞的變化。通過解剖成年 KY 鼠、KrasLSLG12D/+，p53fl/fl，Rosa26LSL-YFP-KPY 鼠和 Rosa26LSL-YFP(Y) 對照小鼠的肺臟制備類器官，并用 FASC 分離 AT2 細(xì)胞。在體外用 Cre 病毒感染細(xì)胞，并在 ALI 共培養(yǎng)系統(tǒng)中與基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。在 Cre 表達(dá)時，幾乎所有的有機(jī)物都是 YFP+，這表明 Cre 的誘導(dǎo)效率很高。

圖 2  scRNA-seq 發(fā)現(xiàn)表達(dá) KRASG12D 的類器官細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征

為了進(jìn)一步表征 KY-CRE 類器官，研究者對如前所述的來自 KY-CRE 和 KY-Emp 類器官的第 7 天 EPCAM + 細(xì)胞進(jìn)行了 scRNA-seq。數(shù)據(jù)確定了 3 個亞群：C0org，C 1org 和 C2org。C1org 主要由 KY-Emp 細(xì)胞組成，代表對照簇，而 C0org 和  C2org 主要包含 KY-CRE 細(xì)胞。相關(guān)分析顯示，所有三個亞群是不同的，且 C0org 和 C1org 呈負(fù)相關(guān)。與對照亞群 C1org 相比，C0org 和 C2org 中的 KRAS 激活的基因集上調(diào)（E 圖）。與 C1org 相比，C2org 中的 NF-kB 激活基因集表達(dá)較低（F 圖），而 C0org 中的則較高，這表明只有一個 Cre 簇具有上調(diào)的 NF-kB 信號傳導(dǎo)（F 圖）。增殖功能基因集僅在 C2org 中升高，而在 C0org 中沒有升高，這表明盡管兩個亞群中的 Kras 激活基因基因集表達(dá)很高，但 Cre 簇中只有一個具有比對照更高的增殖功能基因集（G 圖）。

接下來進(jìn)行 DE 分析，然后識別 TF / TFC。與 GEMM 數(shù)據(jù)相似，對照 C1org 的 Etv5 表達(dá)升高，提供了 AT2 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特性丟失的其他證據(jù)。與對照相比，在兩個 Cre 簇中高表達(dá)的 TF 是 Foxq1，而 C2org 具有 Id1 的高表達(dá)，GEMM 中也檢測到了兩個 TF。有趣的是，C0org 在肺發(fā)育過程中高表達(dá) TFSox9。在同一亞群中，分別指示 Tgfb 和 p53 信號的 Smad7 和 Trp53 也被上調(diào)。

兩個 KY-CRE 亞群 C0org 和 C2org 中 AT2 細(xì)胞的信號減少，類似于 GEMM 數(shù)據(jù)。與此一致的是，AT2 細(xì)胞標(biāo)記 Lyz2 和 Sftpc 以及肺部特征的 TF Nkx2- 1 的表達(dá)降低（I）。相比之下，兩個 KY-CRE 簇中的肺發(fā)育基因 Hmga2 和 Sox9 均被上調(diào)（I 和 J）。此外，還發(fā)現(xiàn) Sox9 靶基因集在 C0org 中上調(diào)，表明 Sox9 在這個亞群中高度表達(dá)和活躍（K）。接下來，研究者想驗證在 GEMM 中的 YFP+ 亞群中是否也上調(diào)了 Sox9。令人驚訝的是，與 YFP-C0 集群相比，YFP+C1 亞群中的 Sox9 和 Sox9 目標(biāo)激活相關(guān)基因顯著上調(diào)。值得注意的是，與類器官數(shù)據(jù)相比，GEMM 模型中的變化要細(xì)微得多，表達(dá)水平也更低。為了確定兩個 KY-CRE 簇是否代表癌細(xì)胞發(fā)展的兩個不同階段，以及是否從一個簇過渡到另一個簇。研究者用 RNA velocity 分析了類器官和 GEMM scRNA-seq 數(shù)據(jù)集。在類器官數(shù)據(jù)中，RNA velocity 表明表達(dá) KRASG12D 的 AT2 細(xì)胞從 Sox9LOW 過渡到 Sox9HIGH 細(xì)胞（圖 L）。相比之下，盡管 C1 GEMM 亞群顯示出明確的過渡方向，但它并不僅僅針對 Sox9 + 細(xì)胞。觀察到的差異可能是由于 GEMM 中 Sox9 的表達(dá)水平明顯降低。

總體而言，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) GEMM 與體外誘導(dǎo)的腫瘤類器官系統(tǒng)之間存在許多相似之處。值得注意的是，兩個模型中的 AT2 細(xì)胞譜系基因均被下調(diào)，而發(fā)育和祖細(xì)胞基因均被上調(diào)，這提供了在 LUAD 早期發(fā)生分化損失的證據(jù)。

三、人 iAT2s 下調(diào) KRASG12D 表達(dá)的分化和上調(diào)祖細(xì)胞的標(biāo)記

圖 3   人 iAT2s 下調(diào) KRASG12d 表達(dá)的分化和上調(diào)祖細(xì)胞的標(biāo)記

為了驗證 KRASG12D 誘導(dǎo)后早期 AT2 分化標(biāo)志物的丟失是否也可以在人類細(xì)胞中觀察到，研究者又設(shè)計了一個 IPSC 系，允許多西環(huán)素（Dox) 調(diào)節(jié) iPSC 衍生的 AT2(IAT2) 細(xì)胞中 KRASG12D 的激活。利用 IPSC 系 BU3 NKX2-1-GFP；SFTPC-tdTomato(NGST)，其中包括分別針對內(nèi)源性 NKX2- 1 和 SFTPC 基因座的 GFP 和 tdTomato 報告基因，將 KrasG12D 盒與 Dox 誘導(dǎo)啟動子一起整合到 AAVS1 基因座中（圖 A）。接下來將 iPSCs 分化為 NKX2-1 + 肺上皮祖細(xì)胞，通過 FACS 篩選 NKX2-1GFP + 細(xì)胞，并使用肺定向分化方案生成遠(yuǎn)端肺泡球（圖 B）。為了更好地了解 SFTPC 的丟失，作者進(jìn)行了 scRNA-seq（圖 B）。使用 10X Chromium 平臺，分析了 775 個 DMSO 和 1,322 個經(jīng)過 dox 處理的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，并進(jìn)行了 DE 分析。所有細(xì)胞的無偏分析顯示了 3 個細(xì)胞簇，對照 iAT2 細(xì)胞歸為一個簇。DE 分析顯示在兩個經(jīng) dox 處理的群集中 KRAS 均顯著上調(diào)，其中之一也顯示了增殖標(biāo)志物（例如 MKI67，TOP2A 和 CDK1）的顯著上調(diào)（圖 F）。相反，在對照簇中多個 AT2 細(xì)胞基因被顯著上調(diào)（例如，LPCAT1，SFTPB，SFTPC，CRLF1，CTSH，SLC34A2，NAPSA 和 PGC）。

與這一觀察結(jié)果一致，先前發(fā)表的 iAT2 細(xì)胞分化（SFTPB、SFTPC、SFTPD、CLDN18、LAMP3、SLC34A2、IL8 和 NAPSA) 和成熟（SFTPA1、SFTPA2、PGC、CXCL5 和 SLPI) 基因集和來自 Panglao 數(shù)據(jù)庫的 20 個小鼠與人共享的 AT2 細(xì)胞標(biāo)記在 DOX 處理的 iAT2 細(xì)胞（圖 G) 中顯著下調(diào)，作者在 GEMM 和小鼠器官數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)了 TF ETV5。此外，TFs FOXQ1 和 ID1 以及發(fā)育和祖基因 SOX9 和 ETV4 均被上調(diào)，這也與我們的鼠類數(shù)據(jù)一致（圖 H）。經(jīng) dox 處理的 iAT2 細(xì)胞中另一個顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物是 TM4SF1，報道為 AT2 標(biāo)記，在體內(nèi)再生過程中富含 Wnt 反應(yīng)細(xì)胞（圖 H）。

人 iAT2 細(xì)胞結(jié)果表明 KRASG12D 導(dǎo)致 iAT2 分化和成熟標(biāo)志物的下調(diào)以及祖細(xì)胞和發(fā)育標(biāo)志物的上調(diào)，從而證實了 GEMM 和鼠類器官模型的結(jié)果。

四、人早期 LUAD AT2 細(xì)胞分化成熟標(biāo)志物下調(diào)

為了評估在 GEMM、小鼠類器官和人 iAT2 細(xì)胞模型中觀察到的 AT2 細(xì)胞特性的喪失是否也發(fā)生在肺癌患者中，作者對激活了 KRAS 突變的 LUAD 樣本和來自兩期 IA LUAD 患者的癌旁組織（距離腫瘤 >2 厘米）進(jìn)行了 scRNA-seq (圖 A)。非監(jiān)督聚類確定了上皮（EpCAM+)、成纖維細(xì)胞（COL1A1+) 和內(nèi)皮（PECAM1+) 細(xì)胞亞群（圖 B、E)。上皮細(xì)胞進(jìn)一步分為 AT1(PDPN+)、Club(SCGB1A1+)、纖毛（FOXJ1+) 和兩個不同的 AT2 細(xì)胞簇，一個由正常肺組織的 AT2 細(xì)胞組成，另一個由 LUAD 的 AT2 細(xì)胞組成（圖 C -E)。來自正常肺的 AT2 細(xì)胞以 SFTPB 和 SFTPD 高表達(dá)為特征，而來自 1A LUAD 階段的 AT2 細(xì)胞具有 SFTPD 低表達(dá)（圖 E）。有趣的是，AT2 細(xì)胞是在 LUAD 和正常肺組織中形成不同簇的上皮細(xì)胞類型，而其他細(xì)胞類型卻聚集在一起（圖 B 和 C），這與我們在 KRASG12DGEMM 中的觀察結(jié)果一致。接下來，作者檢查了來自 Panglao 數(shù)據(jù)庫的小鼠和人類之間共有的 20 種 AT2 細(xì)胞標(biāo)記在 LUAD 患者的 AT2 細(xì)胞中的表達(dá)。所有 20 種標(biāo)記物均在正常肺和 LUAD AT2 細(xì)胞中高表達(dá)，但在其他細(xì)胞類型中均未高表達(dá)，從而證實 AT2 細(xì)胞亞群注釋在正常肺和 LUAD 中是合適的（圖 F）。但是，與正常肺的 AT2 細(xì)胞相比，IA LUAD 階段的 AT2 細(xì)胞表達(dá)的這些標(biāo)志物水平降低，這與作者在 GEMM，鼠類器官和人類 iAT2 細(xì)胞模型系統(tǒng)中的發(fā)現(xiàn)一致（圖 F）。作者認(rèn)為這是人類早期 LUAD 患者樣品中 AT2 細(xì)胞特征丟失的首篇文獻(xiàn)。

圖 4  GEMM，鼠和人類器官模型以及早期 LUAD 患者數(shù)據(jù)集的比較

為了進(jìn)一步比較四個 scRNAseq 數(shù)據(jù)集，作者使用 DE 分析獲得的基因集和先前發(fā)布的基因集，計算了鼠類 KrasG12D 類器官數(shù)據(jù)集中每個細(xì)胞的 Z -score。如預(yù)期的那樣，來自 GEMM 的對照 AT2 細(xì)胞與對照鼠類器官 AT2 細(xì)胞相關(guān)。類器官控制 AT2 群 C1 與 GEMM 模型中的 AT2 細(xì)胞 YFP+ 群 marker 基因相似（圖 G）。此外，具有致癌性 KRAS 的鼠類類器官細(xì)胞和具有致癌性 KRAS 的 GEMM 細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上是相似的。鼠類器官 C0 和 C2 與 AT2 細(xì)胞的 YFP + GEMM 相關(guān)。人類 KRAS iAT2 和 KRAS 突變患者數(shù)據(jù)集與鼠類 KRASG12D 細(xì)胞 marker 基因相似，其中 iAT2 和患者細(xì)胞與 C0 相似。此外，作者從一份使用 KrasG12DGEMM 的報告（Neidler 等人，2019）中發(fā)現(xiàn)，研究者的鼠類器官與肺癌進(jìn)展（“LUAD 進(jìn)展”）的基因表達(dá)特征相關(guān)。類器官的數(shù)據(jù)集還與 HALLMARK_ WNT 基因集，證明了研究者開發(fā)的類器官可代替 GEMM，因為已顯示 Wnt 途徑在肺癌進(jìn)展中起重要作用。

總結(jié)

綜上所述，作者的數(shù)據(jù)表明，成熟的 AT2 轉(zhuǎn)錄程序的減少是 KRAS 驅(qū)動的 LUAD 啟動的重要早期步驟。此外，在 GEMM 和人類 IA LUAD 期患者中證明，在 KRAS 腫瘤發(fā)生的早期階段，只有 AT2 細(xì)胞轉(zhuǎn)換到轉(zhuǎn)錄上截然不同的狀態(tài)。此外，體外誘導(dǎo)的類器官系統(tǒng)囊括了早期 LUAD 進(jìn)展的核心成分，為肺癌生物學(xué)研究提供了簡便的模型。