好不容易拿到了自己的空間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，心情激動(dòng)、躍躍欲試，想趕快去實(shí)施一下自己的 idea，可是又不會(huì)寫代碼，只能干等著？當(dāng)然不是，其實(shí) 空間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù) 你完全可以實(shí)現(xiàn)不寫代碼完成自己大部分?jǐn)?shù)據(jù)挖掘的工作。
這里輪到有用的工具 10x genomic Loupe Browser 上場了！Loupe Browser 是 10x genomics 專門開發(fā)的用于 10x 相關(guān)產(chǎn)品可視化的工具，它其實(shí)可以完成很大部分的數(shù)據(jù)挖掘工作，而且操作簡單，自己有 空間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù) 或單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的確實(shí)可以好好利用一下這個(gè)軟件。
Loupe Browser 下載地址：
https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/downloads/latest?
下載后直接雙擊安裝就可。
數(shù)據(jù)準(zhǔn)備
Loupe Browser 導(dǎo)入的是 Space Ranger 軟件生成的 cloupe.cloupe 文件。10x genomic Space Ranger 軟件的使用教程可參考：
空間轉(zhuǎn)錄組第二講：Space Ranger 的使用
前面也介紹過，我們做空間轉(zhuǎn)錄組測序一般不太可能只做一個(gè)樣本，一般會(huì) 做空間轉(zhuǎn)錄組測序 多個(gè)樣本同時(shí)分析，因?yàn)樾枰M(jìn)行 空間轉(zhuǎn)錄組測序目標(biāo) 亞群數(shù)目和基因表達(dá)差異的比較，這時(shí)候就需要把 空間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù) 多個(gè)樣本整合起來一起分析。用 Loupe Browser 挖掘 數(shù)據(jù)也是一樣，盡量使用多樣本整合后的 cloupe.cloupe 文件。
10x genomic 的軟件 spacerangeraggr 來合并多個(gè)空間轉(zhuǎn)錄組測序的樣本使用教程可參考：
空間轉(zhuǎn)錄組第五講：10x spaceranger aggr 合并多個(gè)樣本
如果前面用 seurat 對數(shù)據(jù)進(jìn)行來了分析，我們也可以把 seurat 聚類的結(jié)果導(dǎo)入到 Loupe Browser 中進(jìn)行數(shù)據(jù)后續(xù)的挖掘（cloupe.cloupe 文件也是需要準(zhǔn)備的）。
軟件操作介紹
一、文件讀取和 Loupe Browser 整體界面介紹
文件讀取可以選擇簡單的方式，就是雙擊自己的 cloupe.cloupe 文件，當(dāng)然前提是你已經(jīng)安裝好 Loupe Browser 軟件。然后會(huì)進(jìn)入如下界面：
A 區(qū)為圖像展示和操作區(qū)，可以對組織圖像進(jìn)行操作，也可以展示降維聚類后的 tsne 或 umap 分布圖。
B 區(qū)主要對亞群、基因、樣本選擇進(jìn)行操作。
C 區(qū)展示差異基因的結(jié)果。
二、查看亞群總體分布
這里可以查看 tsne（umap）圖亞群的分布，也可以查看每個(gè)樣本組織切片上亞群的分布。
三、對圖像區(qū)域進(jìn)行操作
主要包括 3 個(gè)工具，箭頭展示對應(yīng)點(diǎn)的亞群信息，套索可以選中某個(gè)區(qū)域進(jìn)行操作，可以進(jìn)行分類或?qū)С?，后一個(gè)畫筆可以對單個(gè)點(diǎn)進(jìn)行選擇，也可以進(jìn)行分類或?qū)С觥?/font>
在這里我們用套索工具挑選了兩群細(xì)胞，同時(shí)又用畫筆給第二群細(xì)胞增加了幾個(gè)細(xì)胞，因?yàn)橛袝r(shí)候我們想把個(gè)別分散的點(diǎn)加到亞群里去，這個(gè)用套索工具是沒辦法實(shí)現(xiàn)的。
根據(jù)組織切片染色來圈范圍。有時(shí)候我們只需要跟組織染色的結(jié)果來進(jìn)行分組劃分區(qū)域，這時(shí)候顯示 spot 點(diǎn)的信息反而會(huì)使組織圖像看不清楚，這里可以使用 spot opacity 工具來調(diào)整 spot 的透明度，甚至完全去掉亞群信息，然后再根據(jù)組織切片圖像進(jìn)行區(qū)域的選擇。
四、對亞群進(jìn)行選擇
在右邊區(qū)域?qū)喨哼M(jìn)行選擇，可以選中自己想要查看的亞群，然后展示該亞群在樣本組織圖和 tsne（或 umap）降維聚類圖中的分布。
五、對樣本進(jìn)行選擇
對于數(shù)據(jù) tsne 或 umap 的可視化結(jié)果同樣可以對樣本進(jìn)行選擇展示，查看每個(gè)樣本的位置分布。
六、查看基因表達(dá)
右邊上方選擇 Gene/Feature Eexression，然后下面空白框中輸入需要查看的基因，就可以查看這個(gè)基因在亞群以及樣本中的表達(dá)分布情況。
七、Marker 基因查看
在界面的下方，可以查看每個(gè)亞群對應(yīng)的 marker 基因信息包括 P 值、FC 等，也可以把 marker 基因差異結(jié)果表格導(dǎo)出來。
從上面的操作中可以看發(fā)現(xiàn)，不但可以查看和導(dǎo)出亞群上調(diào)的基因，也可以導(dǎo)出下調(diào)的基因，基因數(shù)目則可以選擇 top20、50、100 或者所有基因。
導(dǎo)出的 marker 基因表格如下：
雖然我們只選擇某個(gè)亞群的 marker 基因，但是實(shí)際上軟件會(huì)把這些基因在所有亞群中的差異信息值都導(dǎo)出來。主要包括三列：亞群的平均表達(dá)值、log2 foldchage、pvalue。
八、導(dǎo)入自己的 tsne 降維和分類結(jié)果
前面我們看到的亞群分類和 tsne 降維結(jié)果都是 10x spaceranger 軟件自己計(jì)算出來的，有時(shí)候我們自己用其他軟件（比如 Seurat）分析后得到的結(jié)果也想用 Loupe Browser 軟件來進(jìn)行可視化和數(shù)據(jù)的挖掘，這時(shí)候可以選擇將自己的亞群分類結(jié)果和 tsne 降維坐標(biāo)信息導(dǎo)入軟件內(nèi)，替代原有的亞群分類和 tsne 降維展示。
文件準(zhǔn)備
tsne 坐標(biāo)文件 data_tsne.csv：包括 3 列信息（barcode、tSNE_1、tSNE_2）
Cluster 分群文件 data_cluster.csv，除了分群信息我們也可以加入樣本分組信息。
注意文件必須是 csv 格式，且 barcode 的 id 要與 10x spaceranger 跑出的結(jié)果一致。
導(dǎo)入文件
開始數(shù)據(jù)挖掘
重點(diǎn)來咯，敲黑板啦！
前面介紹了 Loupe Browser 的基本操作，下面來介紹一下怎么利用該軟件進(jìn)行有效的空間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)挖掘。
一、亞群聚類結(jié)果的選擇
從前面的介紹我們知道這里既可以使用 10xspaceranger 軟件聚類的結(jié)果，也可以導(dǎo)入 Seurat 聚類的結(jié)果。如果同時(shí)有著兩種結(jié)果可以選擇，那么我們可以挑選一個(gè)更優(yōu)的結(jié)果進(jìn)行后面的分析。理論上這兩種聚類的結(jié)果我們都可以選擇用來進(jìn)行后續(xù)的分析，那么哪個(gè)更好就需要自己來判斷一下那種結(jié)果更符合自己的預(yù)期了?？梢詮膸讉€(gè)方面來判斷：
A、樣本的分布情況：一般來說如果聚類后如果樣本之間沒有交集互相獨(dú)立，這樣的結(jié)果不是很理想的，說明沒有有效的去除個(gè)體差異。但是因?yàn)榭辙D(zhuǎn)的數(shù)據(jù)比較特殊，本身不同切片不同區(qū)域很難做到 RNA 捕獲的均一性，有時(shí)候不同樣本的數(shù)據(jù)差異就是很大，強(qiáng)行通過歸一化或其他方法去除個(gè)體差異反而會(huì)使結(jié)果失真。
注：這個(gè)示例圖左邊是 spaceranger 的結(jié)果，右邊是 Seurat 聚類的結(jié)果，單從樣本分布來看 spaceranger 的結(jié)果是更佳的。
B、結(jié)合組織切片染色結(jié)果來判斷：組織切片區(qū)域的構(gòu)成、病理狀態(tài)的分布對于判斷亞群的分布是否符合預(yù)期可能更有用。比如說從組織切片上已經(jīng)知道某個(gè)區(qū)域就是屬于某一類細(xì)胞，那么這一區(qū)域的細(xì)胞聚成一類的結(jié)果肯定更合適的。
注：示例圖里 spaceranger 的結(jié)果（左邊）相對來說比 seurat 的聚類結(jié)果（中間）更符合組織切片上的紋路。
二、亞群分布比較
我們拿到數(shù)據(jù)的首步，一般會(huì)先看一下不同亞群在不同樣本里的分布情況，哪些亞群是共有的，哪些亞群是樣本特有的，哪些亞群數(shù)目變化比較大的。如果有做生物學(xué)重復(fù)還可以看一下重復(fù)性效果怎么樣。由于軟件只能一個(gè)樣本一個(gè)樣本的查看，這時(shí)候我們可以把圖片截圖下來放到一起來展示。對于亞群數(shù)目的比較，如果自己可以寫代碼用圖形化展示出來肯定是先進(jìn)的，如果不會(huì)寫代碼也可以把亞群對應(yīng)的數(shù)字輸入到 excle 表格里直接進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
從示例圖例我們可以發(fā)現(xiàn)兩種切片的生物學(xué)重復(fù)還是很好的。7、11 號(hào)群是 posterior 樣本特有的，6、8、9 號(hào)群是 anterior 樣本特有的。后面我們也可以重點(diǎn)關(guān)注這些群到底屬于什么細(xì)胞類型。
三、細(xì)胞類型注釋
空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)不是真正的單細(xì)胞水平，每個(gè) spot 會(huì)捕獲 5 -10 個(gè)細(xì)胞，這樣每個(gè) spot 里實(shí)際上可能存在幾種不同類型的細(xì)胞。但是對于大部分組織細(xì)胞來說同一區(qū)域周圍更可能分布著相同類型的細(xì)胞，這樣對應(yīng)的 spot 孔里面更容易捕獲到同一種細(xì)胞（或者 splot 里的大部分細(xì)胞屬于同一類型）。所以對空間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞類型注釋有利判斷不同組織細(xì)胞類型的大致空間分布信息。對于免疫細(xì)胞要研究它的空間分布往往是比較困難的，它常常會(huì)散布整個(gè)組織上，而且聚類的時(shí)候也比較難得到集中的免疫細(xì)胞群。
做亞群細(xì)胞類型注釋的方法一般有兩種，一種是用專門的軟件去做注釋（如 singleR），還有一種就是根據(jù)已知 maker 基因的表達(dá)來對亞群進(jìn)行注釋判斷。這里我們采用第二種方法。
細(xì)胞類型 marker 基因來源
細(xì)胞類型 marker 基因的可以是自己從文獻(xiàn)中收集的，也可是從一些單細(xì)胞 marker 基因數(shù)據(jù)庫里找來的。這里我們主要來介紹怎么使用 CellMarker 數(shù)據(jù)庫里的細(xì)胞 marker 基因來做注釋。CellMarker 數(shù)據(jù)庫收錄了 158 種組織 / 亞組織的 467 種人細(xì)胞類型，81 種組織 / 亞組織的 389 種鼠細(xì)胞類型。數(shù)據(jù)主要來源于文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫，包括單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)和生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
網(wǎng)址：http://biocc.hrbmu.edu.cn/CellMarker/
數(shù)據(jù)庫主界面：
我們的示例數(shù)據(jù)是小鼠的，這里我們點(diǎn)擊小鼠圖標(biāo)，出現(xiàn)下面界面。
選擇組織類型：這里我們選小鼠腦，鼠標(biāo)點(diǎn)擊腦的圖標(biāo)會(huì)出來對應(yīng)的細(xì)胞類型，一共 22 種細(xì)胞。
然后點(diǎn)擊某個(gè)細(xì)胞類型會(huì)進(jìn)入該細(xì)胞類型 marker 基因的界面，例如點(diǎn)擊星形膠質(zhì)細(xì)胞，出現(xiàn) Astrocyte 細(xì)胞的 marker 基因詞云圖。
字體越大表示標(biāo)志物生物學(xué)證據(jù)越多，右邊有標(biāo)志物生物學(xué)證據(jù)數(shù)目的排序。一般我們選擇 3 - 5 個(gè)排名靠前的 marker 基因來注釋細(xì)胞就好了，太多反而容易造成干擾。這里我們選擇前 3 個(gè)基因 Gfap、Aldh1l1、Atp1b2 來進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞的注釋。
Loupe Browser 展示 marker 基因
按照前面的操作說明，右邊上方選擇 Gene/Feature Eexression，然后下面空白框中輸入需要查看的基因。為了方便查看基因在每個(gè)亞群里的表達(dá)可以使用 Loupe Browser 的網(wǎng)格分割的展示方式。
我們可以把幾個(gè)基因的結(jié)果截圖下來合并到一起來分析。有時(shí)候藍(lán)色看起來表達(dá)差異不明顯，也可以點(diǎn)擊軟件右下角的顏色工具替換色系。
GFAP
Aldh1l1
Atp1b2
看到這 3 個(gè)基因的表達(dá)分布圖，基因之間的表達(dá)分布并不是那么一致，尤其是第 3 個(gè)基因都看不出哪個(gè)亞群高哪個(gè)亞群低。這種情況在空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)或單細(xì)胞數(shù)據(jù)中是經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)的。這時(shí)候我們一般優(yōu)先參考排序靠前的也就是更經(jīng)典的 marker 基因的結(jié)果。GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)典的 marker，從它表達(dá)分布來看 2 號(hào)和 13 群的表達(dá)更高一點(diǎn)，尤其是 13 號(hào)群。從第二個(gè) marker 基因 Aldh1l1 的表達(dá)來看 13 號(hào)群也相對更高一點(diǎn)。所以我們先暫定這 13 號(hào)群為 Astrocyte 細(xì)胞群。
細(xì)胞類型輔助判斷方法
有時(shí)候用上面的方法我們還不能完全確認(rèn)某個(gè)亞群的細(xì)胞類型，這時(shí)候我們可以借助第二種方法進(jìn)一步判斷，就是利用自己數(shù)據(jù)亞群的 marker 基因來分析。這里我們首先把 13 號(hào)群的 marker 基因表格導(dǎo)出來，前面已經(jīng)講述了導(dǎo)出亞群 marker 基因的方法。
步驟一：看亞群 marker 基因的交集
這里我們發(fā)現(xiàn) GFAP 確實(shí)是 13 號(hào)亞群的特異的 marker 基因，且平均表達(dá)值和 log2FC 還挺大的。
步驟二：看亞群 marker 基因富集到的功能
這里利用 KOBAS 3.0 進(jìn)行富集分析，這個(gè)軟件使用起來很簡單，幾乎看一眼就會(huì)，而且它 3.0 版本 2019 年進(jìn)行了更新，里面收錄的數(shù)據(jù)庫也比較全比較新。
網(wǎng)站：http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/
選擇物種（這里選擇小鼠），把 marker 基因 gene symbol 復(fù)制粘貼進(jìn)去。
選擇用來富集的庫，這里我們選擇 GO 功能可能更有利于細(xì)胞類型的判斷。
點(diǎn)擊 run 提交，等待幾分鐘出現(xiàn)下面界面：
點(diǎn)擊 download 下載結(jié)果文件，結(jié)果表格如下：
我們通過文獻(xiàn)或資料先找到 Astrocyte 細(xì)胞細(xì)胞的主要功能，然后再看富集結(jié)果中是否正好富集到這些功能，這樣可以幫助我們進(jìn)一步確認(rèn)亞群的注釋結(jié)果是否正確。
修改亞群名稱
確認(rèn)好亞群的細(xì)胞類型之后，我們就可以在 Loupe Browser 上直接修改 lable 了。
該類型的細(xì)胞分布展示
當(dāng)我們確定了亞群屬于什么細(xì)胞之后，接著可以來查看這一細(xì)胞類型在組織圖片上的分布了。從這上面也許我們也能找到一些有價(jià)值的信息。
這里我們發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的分布其實(shí)還蠻有意思的。
四、細(xì)胞亞群在不同分組中的差異分析
當(dāng)我們找到自己關(guān)注的細(xì)胞類型或亞群之后，下一步就可以去分析這種細(xì)胞類型（或亞群）在不同組織處理或是不同病例狀態(tài)下的基因差異和功能差異?？梢允菢颖局g比較，也可以是樣本分組之后的比較。比如說比較腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶上皮細(xì)胞基因表達(dá)的差異。這里我們就用分析前矢狀面（Sagittal-Anterior）和后矢狀面（Sagittal-Posterior）亞群的差異來展示一下方法。
進(jìn)行差異分析之前我們需要先手動(dòng)制作分類文件，因?yàn)?LoupeBrowser 需要根據(jù)選擇的分組來進(jìn)行差異分析。先導(dǎo)出亞群分類表格，接著導(dǎo)出細(xì)胞樣本對應(yīng)表格，再將兩個(gè)表格進(jìn)行合并來設(shè)置分類。后將做好的分類文件重新導(dǎo)入 Loupe Browser 中。
制作分組文件表格
這里我們比較 13 號(hào)亞群 Astrocyte 細(xì)胞作為示例來展示怎么分析差異。新做好的分組文件如下，把 13 號(hào)群的細(xì)胞分成了 Sagittal-Anterior_Astrocyte 和 Sagittal-Posterior_Astrocyte 兩組。注意文件存為 csv 格式。
分析差異
接著把分組文件導(dǎo)入到 Loupe Browser 中，利用 Loupe Browser 右下角的計(jì)算機(jī)工具計(jì)算兩組的差異，分析 Astrocyte 細(xì)胞在兩組之間的差異基因。
注意：因?yàn)槲覀冎皇窍敕治鲞@兩組之間的差異，所以右下角的 SignificantFeature Comparison 選擇 Locally Distinguishing，否則會(huì)計(jì)算出來這兩個(gè)分組相對于所有細(xì)胞之間的差異基因。
功能富集
后我們可以將前面得到的差異基因用 KOBAS 3.0 進(jìn)行富集分析，分析 Astrocyte 細(xì)胞在兩組之間的功能差異。
五、結(jié)合組織區(qū)域分布對數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘
大部分組織其實(shí)是有其特定的區(qū)域劃分的，比如說大腦里有皮層、丘腦、海馬、脈絡(luò)叢等多個(gè)區(qū)域。將組織的區(qū)域劃分和亞群（或細(xì)胞類型）的分布結(jié)合起來還是能發(fā)現(xiàn)很多有價(jià)值的信息的。
組織分區(qū)
可以根據(jù)這些區(qū)域特異表達(dá)的 maker 基因的分布來判斷每個(gè)區(qū)域在組織切片上的位置。
皮層 marker 基因 STX1A 的表達(dá)分布：
丘腦 marker 基因 PRKCD 的表達(dá)分布：
海馬 marker 基因 HPCA 的表達(dá)分布：
脈絡(luò)叢 marker 基因 TTR 的表達(dá)分布：
不同區(qū)域的亞群分布
找到了對應(yīng)的區(qū)域之后，下一步就可以研究每個(gè)區(qū)域主要有哪些亞群，包括哪些細(xì)胞類型，不同區(qū)域之間細(xì)胞類型之間的差異，不同區(qū)域之間功能的差異。
將這個(gè)數(shù)據(jù)的區(qū)域分布圖和亞群分布圖結(jié)合起來看的時(shí)候其實(shí)能發(fā)現(xiàn)一些挺有意思的現(xiàn)象。1、4、15 號(hào)群基本上都分布在皮層，17 號(hào)群對應(yīng)丘腦，脈絡(luò)叢對應(yīng) 20 號(hào)群。
選中 1、4、15 號(hào)群
選中 17 號(hào)群
選中 20 號(hào)群
這里如果有多個(gè)樣本分組的話（病理狀態(tài)、疾病分期等等），則可以統(tǒng)計(jì)在不同分組下每二個(gè)區(qū)域亞群的分布情況，比如說皮層區(qū)在正常狀態(tài)下 1 號(hào)亞群起主要作用，在疾病狀態(tài)下 4 號(hào)亞群起主要作用。
Marker 基因和功能研究
除了前面說的分析亞群的分布情況，我們還可以分析亞群或整個(gè)區(qū)域的功能變化。比如說分析脈絡(luò)叢對應(yīng)的 20 亞群在正常狀態(tài)和疾病狀態(tài)下特異表達(dá)的 maker 基因以及功能的變化。具體的操作方法跟前面分組差異分析相同，這里不再演示操作步驟。
六、結(jié)合病理學(xué)特征對數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘
空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)正真的精髓不是研究細(xì)胞亞群的分布，而在于將它在空間位置上體現(xiàn)的異質(zhì)性跟組織病理學(xué)特征的分布進(jìn)行結(jié)合，挖掘在不同病理學(xué)特征下轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異。這對于研究疾病病變的機(jī)制、幫助臨床實(shí)現(xiàn)更好的患者分子分型、以及空間位置 Biomarker 的挖掘方面都是非常有價(jià)值的。
比如說我們的組織切片上同時(shí)分布著不同嚴(yán)重程度（或不同類型）的病灶區(qū)，我們可以手動(dòng)把這些區(qū)域圈出來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組層面的比較，找出不同病灶區(qū)的特異性 marker，分析疾病在一步步發(fā)展進(jìn)程中生物學(xué)功能的變化，甚至可以思考一下是否能找出一些關(guān)鍵性因子來阻斷疾病的進(jìn)展。
當(dāng)然也可以結(jié)合前面細(xì)胞類型注釋結(jié)果，分析組織切片不同病理學(xué)特征下某一類細(xì)胞的功能學(xué)的差異，前提條件是這類細(xì)胞在組織上的分布是比較集中的，可以清晰的從圖像上找出來的。
因?yàn)槲覀兊氖纠龜?shù)據(jù)沒有病例學(xué)信息，這里我們隨意選擇兩個(gè)區(qū)域進(jìn)行具體操作演示。首先利用上面中間的套索工具選擇不同病理學(xué)特征對應(yīng)的區(qū)域進(jìn)行命名分組，然后利用坐下角計(jì)算器工具計(jì)算每組特異性的 marker 基因。
導(dǎo)出差異基因接著用 KOBAS 3.0 進(jìn)行富集分析，分析這些基因主要富集到哪些功能上。
得到了差異基因和功能富集的表格，接下來就需要自己認(rèn)真的去里面挖掘有價(jià)值的信息了。
伯豪生物提供從樣本采集至生信全范圍覆蓋的空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)服務(wù)，2020 年空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)剛剛興起之時(shí)，空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)逐漸進(jìn)入科研工作者視野，特別是臨床腫瘤、細(xì)胞免疫等領(lǐng)域的應(yīng)用，未來伯豪生物將繼續(xù)為廣大科研概及臨床工作者提供高效優(yōu)質(zhì)的空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)服務(wù)。
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