標(biāo)題：Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing

期刊：Cell（IF=41.582）

過去的幾十年里，癌癥免疫療法極大地改變了腫瘤治療的局面，諸如檢查點(diǎn)阻斷之類的療法可以顯著改善患者的臨床反應(yīng)，但這些療法的效果在癌癥患者或癌癥類型之間存在極大差別。因此，確定可預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

2017 年 6 月，張澤民教授及其團(tuán)隊(duì)在《Cell》期刊上發(fā)表了題目為“Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing”的研究論文，該研究通過大規(guī)模單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)肝癌相關(guān) T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析，初次在單細(xì)胞水平上描繪肝癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞圖譜，發(fā)現(xiàn)了肝癌免疫療法的潛在靶點(diǎn)，也為我們從多角度系統(tǒng)性理解肝癌 T 淋巴細(xì)胞特征奠定了基礎(chǔ)。

淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫治療中起主要作用。因腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在不同患者及不同癌種間具有高度異質(zhì)性，這些異質(zhì)性導(dǎo)致腫瘤免疫治療效果差異顯著。突變負(fù)荷、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞 ?(TIL) 水平和藥物靶點(diǎn)表達(dá)等幾個(gè)因素與患者對(duì)抗 CTLA4 或抗 PD1 療法的反應(yīng)有一定的相關(guān)性，但這些通常不夠穩(wěn)健，無法統(tǒng)一用作臨床生物標(biāo)志物。因此，確定可預(yù)測(cè)治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物至關(guān)重要，而新型癌癥免疫療法的開發(fā)和有效生物標(biāo)志物的鑒定需要對(duì)腫瘤駐留 T 細(xì)胞的深入了解。

對(duì)照組：來自 6 例肝癌患者的外周血，肝癌組織的 T 細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)組：來自相同 6 位肝癌患者的癌旁正常組織的 T 細(xì)胞

單細(xì)胞 RNAseq，流式細(xì)胞術(shù)

1、肝癌相關(guān) T 淋巴細(xì)胞亞型分析

為揭示肝癌相關(guān) T 淋巴細(xì)胞內(nèi)在特性及其潛在的功能亞型，作者對(duì)來自 6 位肝癌患者外周血、鄰近正常組織和腫瘤組織的 CD8+? 細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（PTC、NTC 和 TTC）和對(duì)應(yīng)位置的 CD4+ CD25- T 細(xì)胞（PTH、NTH 和 TTH）及 CD4+ CD25high T 細(xì)胞（PTR、NTR 和 TTR）進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果降維聚類，共聚類為 11 個(gè) T 細(xì)胞亞群：5 個(gè) CD8+ T 細(xì)胞亞群和 6 個(gè) CD4+ T 細(xì)胞亞群，每個(gè)亞群都有其獨(dú)特表達(dá)的特征基因。其中 C1_CD8-LEF1，主要是來源于外周血，特異性表達(dá) na?ve T 細(xì)胞標(biāo)記基因；C2_CD8-CX3CR1，高表達(dá) T 細(xì)胞效應(yīng)功能相關(guān)基因；C3_CD8-SLC4A10, MAIT（Mucosal-Associated Invariant T cells）細(xì)胞；C4_CD8-LAYN，主要來源于腫瘤組織，高表達(dá)耗竭性標(biāo)記基因；C5_CD8-GZMK，與 C4 存在一些共同表達(dá)的基因，但特異表達(dá) GZMK 基因。其中 C1_CD8-LEF1 T 細(xì)胞亞群和 C2_CD8-CX3CR1 細(xì)胞亞群主要存在于外周血中，MAIT 細(xì)胞主要分布在腫瘤相鄰的正常肝組織中，而在腫瘤組織中主要為耗竭性 CD8+ T 細(xì)胞。

CD4+ T 細(xì)胞分為 6 個(gè)亞群：C6_CD4-CCR7 亞群主要來源于外周血，特異表達(dá)初始 T 細(xì)胞標(biāo)記基因，C7_CD4-FOXP3 主要是外周血分離的 Tregs 細(xì)胞，C8_CD4-CTLA4 是一群在腫瘤組織中高度富集的 Tregs 細(xì)胞，C9_CD8-GZMK，主要是來源正常組織和腫瘤組織中的 Th 細(xì)胞，C10_CD4-CXCL13 是一群耗竭性 CD4 T 細(xì)胞。C11_CD4-GNLY 是一群具有細(xì)胞毒性的 CD4 T 細(xì)胞。

2、HCC 浸潤(rùn)性 Tregs 和耗竭性 CD8+?T 細(xì)胞特有相關(guān)基因的確定

由于 HCC 浸潤(rùn)性 Tregs 細(xì)胞亞群（C8_CD4-CTLA4）和耗竭性 CD8 T 細(xì)胞亞群表達(dá)的共抑制受體（如 PDCD1 和 TIGIT）是癌癥免疫療法的重要靶標(biāo)，因此作者選擇這兩個(gè) T 細(xì)胞亞群做進(jìn)一步的分析。在腫瘤侵潤(rùn)性 Tregs 中共鑒定出 401 個(gè)特異表達(dá)基因，如 FOXP3、CTLA4、TNFRSF18、TNFRSF4 和 CCR8 等；在腫瘤耗竭性 CD8 T 細(xì)胞中，獲得了 82 個(gè)特異性耗竭標(biāo)記基因，其中除了已報(bào)道過的耗竭標(biāo)記基因，還發(fā)現(xiàn)了新的耗竭相關(guān)基因，如 LAYN，PHLDA1 和 SNAP47 等。其中 22 個(gè)耗竭標(biāo)記基因（如 CTLA4 和 LAYN）也在腫瘤侵潤(rùn)性 Tregs 細(xì)胞中高表達(dá)。

上述結(jié)果中，作者發(fā)現(xiàn) LAYN 基因在腫瘤侵潤(rùn) Tregs 和耗竭性 CD8+ T 細(xì)胞中特異性表達(dá)，且 LAYN 的高表達(dá)與低生存率有關(guān)。因 LAYN 是一種細(xì)胞表面蛋白，作者通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，靜息期的 CD14+ 髓細(xì)胞、B 細(xì)胞、CD4+ T 細(xì)胞、Tregs 或 CD8+ T 細(xì)胞中并不表達(dá) LAYN，但用抗 CD3 和抗 CD28 抗體激活 T 細(xì)胞 2 天后，超 30% 的 Tregs 細(xì)胞和 CD8+ T 細(xì)胞中檢測(cè)到了 LAYN 的表達(dá)。已知 FOXP3 是 Treg 細(xì)胞分化和功能相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而轉(zhuǎn)錄因子 Helios 能夠穩(wěn)定 FOXP3 的表達(dá)，抑制 Tregs 細(xì)胞功能。因此，作者進(jìn)一步分析了 FOXP3+ Helios+ Tregs 細(xì)胞中 LAYN 的表達(dá)。結(jié)果顯示，在 FOXP3+ Helios+ Tregs 細(xì)胞中，LAYN 被優(yōu)先上調(diào)，表明 LAYN 可能與 Tregs 細(xì)胞抑制性和穩(wěn)定性有關(guān)。而在 CD8 T 細(xì)胞中過表達(dá) LAYN 后，IFN- γ 明顯減少，說明 LAYN 的表達(dá)與 T 細(xì)胞抑制性有關(guān)，也進(jìn)一步證實(shí)了腫瘤微環(huán)境中的 T 細(xì)胞更易于向耗竭態(tài)轉(zhuǎn)變或存在 Treg 抑制，從而阻止 CD8 T 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用。

3、TCR 分析及擬時(shí)序分析子集映射

已知由同一細(xì)胞分化而來的 T 細(xì)胞具有相同的 TCRs, 作者分析每個(gè)樣本的 TCR 數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，雖然大多數(shù)細(xì)胞含有獨(dú)特的 TCR，但在不同細(xì)胞類型中觀察到不同程度的重復(fù)使用模式，尤其在腫瘤浸潤(rùn) CD8+ T 細(xì)胞和 Treg 中，表明兩種細(xì)胞存在共同的祖先細(xì)胞起源。且腫瘤組織 CD8+ T 細(xì)胞和 Treg 細(xì)胞中 TCR 克隆的數(shù)量顯著高于血液和鄰近正常組織中的數(shù)量，這很可能是腫瘤環(huán)境中局部 T 細(xì)胞增殖和激活的結(jié)果。

擬時(shí)序分析構(gòu)建 CD8+ T 細(xì)胞和 CD4+ T 的發(fā)育軌跡。CD8+ T 細(xì)胞擬時(shí)序結(jié)果顯示，每個(gè)簇中的大多數(shù)細(xì)胞基于表達(dá)相似性聚集，不同的簇在偽時(shí)間中形成連續(xù)分化過程，從 C1_CD8-LEF1 細(xì)胞（幼稚 CD8+ T 細(xì)胞）開始，然后是 C2_CD8-CX3CR1（效應(yīng)記憶 CD8+ T 細(xì)胞）、C5_CD8-GZMK，并以 C4_CD8-LAYN 細(xì)胞（耗竭 CD8+ T 細(xì)胞）結(jié)束。耗竭 T 細(xì)胞在偽時(shí)間后期高度富集，表明 T 細(xì)胞狀態(tài)從激活過渡到耗竭。CD4+ T 細(xì)胞擬時(shí)序分析結(jié)果顯示，C6_CD4-CCR7 幼稚 T 細(xì)胞和 C9_CD4-GZMA T 輔助細(xì)胞主要聚集在偽時(shí)間主干上，C10_CD4-CXCL13（耗竭 CD4+ T 細(xì)胞）和 C11_CD4-GNLY（細(xì)胞毒性 CD4+ T 細(xì)胞）細(xì)胞位于偽時(shí)間軌跡圖中的不同方向，表明這些細(xì)胞在功能上存在差異。

4、HCC 微環(huán)境中耗竭性 CD8+?T 細(xì)胞和 Treg 細(xì)胞克隆富集

隨后作者重點(diǎn)分析了 HCC 腫瘤浸潤(rùn) T 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的效應(yīng) CD8+ T 細(xì)胞顯著減少，而耗竭表型顯著上升。此外，有少量耗竭 CD8+ T 細(xì)胞表達(dá) Treg 標(biāo)記物 FOXP3，這些細(xì)胞還表達(dá)細(xì)胞溶解相關(guān)基因，表明這群細(xì)胞存在抑制性和細(xì)胞殺傷特性。HCC 微環(huán)境促進(jìn)浸潤(rùn)的 CD8+ T 細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樗ソ郀顟B(tài)，從而抑制 CD8+ T 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用。

參考文獻(xiàn)：

1. Zheng C, Zheng L, Yoo J-K, et al (2017) Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 169:1342-1356.e16. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.05.035.