文章標(biāo)題：Oncolytic virotherapy-mediated anti-tumor response: a single-cell perspective

發(fā)表期刊：Cancer Cell

影響因子：31.74

文章導(dǎo)讀

所有疾病中，肝癌致死率第三，而肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma , HCC）約占所有肝癌發(fā)病率的 90%。盡管現(xiàn)免疫療法對(duì)多種腫瘤適應(yīng)癥有臨床益處，但肝癌的應(yīng)答率卻低得多，因此明確肝癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化特征對(duì)于提高免疫治療效果至關(guān)重要。本文結(jié)合兩種單細(xì)胞 RNA 測(cè)序技術(shù)（10x Genomics 和 SMART-seq2），從肝癌組織和其他 4 個(gè)免疫相關(guān)部位分離 CD45+  細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，生成了 HCC 單細(xì)胞免疫圖譜，并且初次系統(tǒng)地探索和比較了 HCC 腫瘤、鄰近肝臟、肝淋巴結(jié) (LN)、腹水和血液中免疫細(xì)胞的細(xì)胞組成、功能狀態(tài)、發(fā)育軌跡和細(xì)胞相互作用，使我們對(duì) HCC 免疫微環(huán)境的動(dòng)態(tài)變化有了更深層的理解。

科學(xué)問(wèn)題

腫瘤微環(huán)境（TME）的細(xì)胞成分高度復(fù)雜，髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在炎癥、腫瘤免疫逃避和免疫治療反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。TME 中髓細(xì)胞的存在通常與患者生存率的改變有關(guān)。據(jù)報(bào)道，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）可阻止 T 細(xì)胞識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞；在小鼠模型中，傳統(tǒng)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）亞群（cDC1 和 cDC2）遷移到腫瘤引流淋巴結(jié)和原始 CD8+ 或 CD4+  T 細(xì)胞。然而，肝細(xì)胞癌患者 TAM 和 DC 亞群的特征和功能尚不清楚。作者之前已經(jīng)通過(guò)單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNA-seq）對(duì)肝癌中的 T 細(xì)胞進(jìn)行了表征，但總體免疫圖譜仍然未知。

實(shí)驗(yàn)分組

16 名未接受治療的肝癌患者的癌組織、癌旁組織、淋巴結(jié)、外周血和腹水中分選的 CD45+  免疫細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵技術(shù)：10x Genomics，SMART-seq2

1. HCC 免疫細(xì)胞圖譜

作者選取 16 名肝癌患者癌組織、癌旁組織、淋巴結(jié)、外周血和腹水中分選的 CD45+  細(xì)胞，分別使用 10x Genomics 和 SMART-seq2 兩種方法進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，將 10x 產(chǎn)生的 66,187 個(gè)細(xì)胞和 SMART-seq2 產(chǎn)生的 11,134 個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)整合聚類，揭示了 HCC 中的主要免疫細(xì)胞類型，包括 T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、髓細(xì)胞、B 細(xì)胞、漿細(xì)胞和 ILC。T、NK 和骨髓細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分，分別產(chǎn)生 14、9 和 14 個(gè)亞群。進(jìn)一步分析細(xì)胞組成發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞類型表現(xiàn)出不同的組織偏好，T 細(xì)胞中，調(diào)節(jié)性 T (Treg) 細(xì)胞和耗竭的 CD8+ T (Tex) 細(xì)胞，增殖性 T 細(xì)胞，在腫瘤中富集，而髓系細(xì)胞主要在腹水中富集。

2. 腹水中的淋巴細(xì)胞和髓細(xì)胞起源不同

為探究腹水中細(xì)胞的潛在起源，作者假設(shè)腹水中的免疫細(xì)胞是從其他組織中積累的。分析發(fā)現(xiàn)，骨髓細(xì)胞主要映射到腫瘤細(xì)胞，淋巴細(xì)胞主要映射到血液、腫瘤和鄰近肝臟中，而在腹水中富集的亞群 Mφ-c5-VCAN 和 Mφ-c6-MARCO 主要映射到腫瘤衍生細(xì)胞?；诰€粒體突變的譜系追蹤結(jié)果顯示，腫瘤組織和腹水中的細(xì)胞具有共同譜系。

隨后作者研究了腹水和其他組織中巨噬細(xì)胞的關(guān)系。基于線粒體突變的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和 RNA 速度分析顯示腹水中的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的特定亞群可能源自腫瘤，巨噬細(xì)胞存在從腫瘤到腹水的遷移過(guò)程。

3. 腫瘤中的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)兩種不同的狀態(tài)（TAM-like 和 MDSC-like)

對(duì)巨噬細(xì)胞重新聚類，共細(xì)分為 6 個(gè)巨噬細(xì)胞簇，其中 Mφ-c1-THBS1 和 Mφ-c2-C1QA 在腫瘤組織中富集，根據(jù)基因的整體表達(dá)情況確定 Mφ-c1-THBS1 為 MDSC 樣巨噬細(xì)胞，Mφ-c2-C1QA 為 TAM 樣巨噬細(xì)胞。生存分析結(jié)果顯示，TAM 樣巨噬細(xì)胞與不良預(yù)后相關(guān)。TAM 樣細(xì)胞的兩個(gè)特征基因 SLC40A1 和 GPNMB 此前也被報(bào)道與不良預(yù)后相關(guān)。因此，作者使用 CRISPR-Cas9 技術(shù)敲除了 THP- 1 單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞的 SLC40A1 或者 GPNMB 基因，結(jié)果證實(shí) GPNMB 促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 TNF-α，而 SLC40A1 促進(jìn)促炎細(xì)胞因子但抑制 IL1β 的產(chǎn)生，暗示 TAM 樣巨噬細(xì)胞可能在炎癥反應(yīng)中起重要作用。

4. LAMP3+ DCs：在腫瘤中具有潛在遷移能力的成熟 DCs

隨后，作者將研究重點(diǎn)集中在腫瘤中富集的 DC 亞群。根據(jù)基因表達(dá)情況，確認(rèn) DC-C1-CD1C 為 cDC2，DC-C3-CLEC9A 為 cDC1，而 DC-c4-LAMP3 不同于已知的 DC 亞型，表達(dá)成熟標(biāo)記和遷移標(biāo)記。據(jù)報(bào)道 LAMP3 與 CD40L 刺激下的 DC 成熟有關(guān)，因此作者進(jìn)一步檢查了 LAMP3+ DC 與其他 DC 亞群之間的關(guān)系。經(jīng)體外刺激實(shí)驗(yàn)和 scRNA-seq 分析，結(jié)果證實(shí)體外成熟刺激誘導(dǎo) LAMP3+ DCs 的產(chǎn)生。此外作者還發(fā)現(xiàn)了 3 個(gè)特殊的亞群：C07，對(duì)應(yīng) cDC2 到 LAMP3+ DCs 之間的過(guò)渡階段，而 C09 和 C10，對(duì)應(yīng) pDCs 和 LAMP3+ DCs 之間的過(guò)渡階段，處于過(guò)渡階段（C07 和 C09）的細(xì)胞表現(xiàn)出向 LAMP3+ DCs 的強(qiáng)烈定向流動(dòng)。遷移能力分析結(jié)果顯示，在 LAMP3+ DC 中，腫瘤衍生細(xì)胞表現(xiàn)出向 LN 中細(xì)胞的定向流動(dòng)。綜上，本次分析確認(rèn)樂(lè) HCC 中具有成熟特征的 LAMP3+ DCs，這些細(xì)胞可能源自 cDC1 和 cDC2，并表現(xiàn)出向 LN 遷移的能力。

5. DCs 與淋巴細(xì)胞的相互作用關(guān)系

為了研究骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞之間的相互作用，作者通過(guò)分析免疫相關(guān)的配體 - 受體（LR）對(duì)以深入了解細(xì)胞簇之間的調(diào)節(jié)關(guān)系。結(jié)果顯示，腫瘤組織中的 DC 亞群通過(guò) CD28/B7 家族和白細(xì)胞介素 -15，與 Tex 細(xì)胞、增殖性 T 細(xì)胞與 Treg 細(xì)胞相互作用。LAMP3+ DCs 在三個(gè) DC 亞群中表現(xiàn)出高的配體數(shù)量，可通過(guò)遷移趨化因子吸引 T 細(xì)胞，利用 CD274/PDCD1LG2-PDCD1 軸來(lái)調(diào)節(jié)多種類型的 T 細(xì)胞，并可能與 T 細(xì)胞功能障礙有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

1. Zhang Q, He Y, Luo N, et al (2019) Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma. Cell 179:829-845.e20. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.003.