液體活檢，目前主要用于癌癥不同階段的篩查和治療。即使在無癥狀人群中，它也可以有效識(shí)別出癌癥早期患者，這一特點(diǎn)使之成為標(biāo)準(zhǔn)腫 瘤檢測(cè)中重要的非侵入性輔助方法。
Cell-free DNA
液體活檢中應(yīng)用很廣泛的分析指標(biāo)是外周血游離 DNA（cfDNA）。此外，還包括其他體液系統(tǒng)中腫 瘤釋放的 cfNA（cfDNA、cfRNA 等）。cfDNA 就是游離于細(xì)胞外的 DNA，它即包含 ctDNA（circulating tumor DNA）也包括來自于正常細(xì)胞的 DNA 碎片。例如，腦脊液、唾液、尿液、胸腔和腹腔積液、糞便等，都是 cfDNA 的潛在來源，上述樣本經(jīng) cfDNA 富集可用于不同類型癌癥的檢測(cè)。在健康個(gè)體中，cfDNA 來源于正常的細(xì)胞更新，而在癌癥患者中 cfDNA 含量會(huì)升高，cfDNA 長度約為 167bp，半衰期不足 1 小時(shí)。
DNA 甲基化
表觀遺傳學(xué)信息如甲基化或蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物結(jié)合 ctDNA 已被證明有助于早期確定腫 瘤的起源。研究人員發(fā)現(xiàn)，來自甲基化組數(shù)據(jù)的腫 瘤和組織特異性模式有助于疾病分類。腫 瘤 DNA 甲基化譜與血漿 ctDNA 甲基化譜高度相關(guān)，可用于乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌和肺癌等疾病的診斷和預(yù)后判斷。然而，與 DNA 變異檢測(cè)類似，cfDNA 中 DNA 甲基化變化程度變化和低起始量，對(duì)檢出技術(shù)的覆蓋率、成本和靈敏度提出了挑戰(zhàn)。
Cell-free DNA 甲基化的臨床應(yīng)用
? 癌癥篩查與早診
在無癥狀人群中，液體活檢可以用于癌癥患者的識(shí)別，以提高早期診斷和更好的干預(yù)。研究表明，腫 瘤 DNA（ctDNA）可用于早期肺癌診斷（I 期或 II 期），具有較高的敏感性和特異性。除了 DNA 突變，DNA 甲基化和 cfDNA 水平的量化可以結(jié)合起來提供穩(wěn)健和一致的結(jié)果。SEPT9 基因甲基化檢測(cè)是通過美國食品與藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)的結(jié)腸直腸癌（CRC) 血液篩查試驗(yàn)，與蛋白質(zhì)標(biāo)記物相比，具有更高的敏感性和特異性。我國食品和藥品監(jiān)督管理局今年也首批了一款結(jié)直腸癌早篩產(chǎn)品，通過結(jié)合基因突變、甲基化檢測(cè)和便隱血測(cè)試，臨床結(jié)果顯示，在 4245 例結(jié)直腸癌高風(fēng)險(xiǎn)人群中，171 例陽性患者終被確診為結(jié)直腸癌，篩查靈敏度達(dá)到 91.1%。
? 微小病灶殘留和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
微小病灶殘留（MRD) 是手術(shù)或治療后腫 瘤復(fù)發(fā)的主要原因。不幸的是，目前還沒有有效的方法來鑒別 MRD 和復(fù)發(fā)。此外，用于復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分層的常規(guī)臨床或病理參數(shù)不足以準(zhǔn)確指導(dǎo)輔助治療，導(dǎo)致患者在大部分患者已治愈且不需要此類潛在有害治療的情況下，仍不得不接受不加區(qū)分的治療。已經(jīng)證實(shí)，ctDNA 甲基化標(biāo)記物可以提示 MRD 的存在，即使在沒有其他臨床疾病證據(jù)的情況下，也可以識(shí)別復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高的患者。將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組將使可能受益大的患者能夠接受輔助治療，同時(shí)使低風(fēng)險(xiǎn)患者免于不必要的合并癥和不良事件的風(fēng)險(xiǎn)。近期，一項(xiàng)前瞻性臨床試驗(yàn)評(píng)估了 II 和 III 期 CRC 患者術(shù)后 ctDNA 標(biāo)志物（WIF1 和 NPY) 與腫 瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系。采集 805 例 II-III 期 CRC 患者術(shù)前和術(shù)后的血漿樣本（NCT00958737)。在手術(shù)切除后隨訪時(shí)，采用 ddPCR 檢測(cè) WIF1 和 NPY 在 ctDNA 甲基化情況。作者觀察到，ctDNA 陰性組 2 年無病生存率顯著高于 ctDNA 陽性組（82% vs 64%)，這表明 ctDNA 甲基化分析可以用于預(yù)測(cè)微小病灶殘留的病變。
? 治療選擇和預(yù)后
cfDNA 的半衰期較短，可以與腫 瘤細(xì)胞狀態(tài)直接相關(guān)，從而為治療期間持續(xù)動(dòng)態(tài)觀察監(jiān)測(cè)癌癥負(fù)擔(dān)提供了可能性。有研究表明 ctDNA 動(dòng)力學(xué)與治療反應(yīng)相關(guān)。例如，血清的 MGMT 的甲基化水平與原發(fā)組織高度，在 cfDNA 中檢測(cè) MGMT 的甲基化水平能夠預(yù)測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者在細(xì)胞毒性治療后的響應(yīng)時(shí)間和進(jìn)展。一項(xiàng)前瞻性研究驗(yàn)證了乳腺癌甲基化特異性 PCR cfDNA 檢測(cè)方法，該方法針對(duì) 6 個(gè)癌癥相關(guān)啟動(dòng)子的 CGI 來監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)。這 6 個(gè)位點(diǎn)的累積甲基化得分與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的生存結(jié)果顯著相關(guān)。
? ctDNA 的組織溯源追蹤
目前除了使用 ctDNA 作為液體活檢來檢測(cè)癌癥的興趣之外，它也可以用于 ctDNA 的起源和腫 瘤的定位。事實(shí)上，在每一種腫 瘤組織和每一種組織中都有獨(dú)特的 DNA 甲基化譜。因此，甲基化譜的差異可以識(shí)別 ctDNA 來源的組織。據(jù)報(bào)道，近期一項(xiàng)研究開發(fā)了組織特異性 DNA 甲基化生物標(biāo)志物，利用基于數(shù)字 PCR 的方法測(cè)量肝臟和結(jié)腸源 DNA 的血漿濃度，并探索其在轉(zhuǎn)移性 CRC 研究中的臨床應(yīng)用。結(jié)果證實(shí)了肝臟特異性標(biāo)記物在反映血漿中肝臟源性 DNA 濃度方面的準(zhǔn)確性（檢測(cè) HCC 的特異性為 93%，敏感性為 60%)。肝源性 DNA 的絕 對(duì) 濃 度有助于有無肝轉(zhuǎn)移的 CRC 患者提供了更好的區(qū)分。這些結(jié)果表明，ctDNA 甲基化有助于腫 瘤發(fā)生的組織溯源。
Cell-free DNA 甲基化的研究方法
參考文獻(xiàn)：
[1] Luo H, Wei W, Ye Z, et al. Liquid Biopsy of Methylation Biomarkers in Cell-Free DNA [J]. Trends Mol Med, 2021, 27(5): 482-500.
[2] Van Der Pol Y, Mouliere F. Toward the Early Detection of Cancer by Decoding the Epigenetic and Environmental Fingerprints of Cell-Free DNA [J]. Cancer Cell, 2019, 36(4): 350-68.
