病毒性神經(jīng)壞死是一種廣泛存在于海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖的疾病，主要影響海魚(yú)，并對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。這種疾病是由神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus, NNV）引起的，它是一種分節(jié)段的正鏈 RNA 病毒，屬于野田病毒科（Nodaviridae）。NNV 是世界范圍內(nèi)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)最重要的威肋之一，近年來(lái)受感染的魚(yú)類(lèi)種類(lèi)、數(shù)量和損害程度都迅速增加。NNVs 直徑約 25-30 nm，為二十面體結(jié)構(gòu)，無(wú)包膜，基因組由 2 段正鏈 RNA 組成。RNA1 編碼 RNA 依賴(lài)性 RNA 聚合酶（RdRp)和非結(jié)構(gòu)蛋白 B，RNA2 編碼衣殼蛋白（CP)。
圖 1. NNV 結(jié)構(gòu)示意圖
NNV 主要感染魚(yú)類(lèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜神經(jīng)系統(tǒng)，可造成 50 多種海洋和淡水硬骨魚(yú)的幼蟲(chóng)和幼魚(yú)種群大量死亡，感染后 1 周內(nèi)死亡率可達(dá) 100%。到目前為止，四種不同的 NNV 物種已經(jīng)被國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)正式認(rèn)定：赤點(diǎn)石斑神經(jīng)壞死病毒（RGNNV）、擬鲹神經(jīng)壞死病毒（SJNNV）、條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒（BFNNV）和紅鰭東方鲀神經(jīng)壞死病毒（TPNNV）。其中 RGNNV 傳播最為廣泛，感染這種病毒的魚(yú)表現(xiàn)出臨床癥狀，包括有不同程度的神經(jīng)異常行為（如不正常游動(dòng)、喪失平衡能力、做螺旋或翻圈泳姿，靜止時(shí)腹部朝上）和體色變深等。RGNNV 不僅感染石斑魚(yú)，還感染許多其它經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的海洋魚(yú)類(lèi)，包括歐洲鱸（Dicentrarchus labrax) 和日本真鱸（Lateolabrax japonicus)。
圖 2. NNV 衣殼蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析
目前，還沒(méi)有有效治療這些 NNVs 引起的疾病的方法。不過(guò)，如果能及早發(fā)現(xiàn)病毒，就可以采取有效措施，減少病毒對(duì)健康養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的傷害。因此，為了實(shí)現(xiàn)可用于及時(shí)止損的的養(yǎng)殖場(chǎng)檢測(cè)策略，建議在水產(chǎn)養(yǎng)殖期間使用分子檢測(cè)方法定期監(jiān)測(cè)，以確保魚(yú)類(lèi)不受 RGNNV 感染。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、高靈敏度的檢測(cè) NNVs 的方法對(duì)于疾病預(yù)防和控制至關(guān)重要。
01、基于 CRISPR/Cas13a 的 RGNNV 檢測(cè)原理
華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院王慶課題組開(kāi)發(fā)了一種基于 CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)快速檢測(cè)赤點(diǎn)石斑神經(jīng)壞死病毒（RGNNV)的方法，該方法具有高靈敏度和高特異性，為 RGNNV 的即時(shí)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了新方案。
整個(gè)檢測(cè)過(guò)程如下，將 Cas13a 和 crRNA 進(jìn)行共孵育形成 Cas13a/crRNA 復(fù)合物，該復(fù)合物可以特異性的識(shí)別 RGNNV 靶標(biāo)核酸。當(dāng)靶標(biāo)被 crRNA 特異性識(shí)別后，Cas13a 的反式切割活性被激活，開(kāi)始切割 RNA 報(bào)告探針，發(fā)出檢測(cè)信號(hào)。
圖 3. 基于 CRISPR/Cas13a 的 RGNNV 檢測(cè)原理
02、CRISPR/Cas13a 檢測(cè)靶標(biāo) RNA 的可行性分析
CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)依靠 crRNA 和 Cas13a 進(jìn)行核酸檢測(cè)，通過(guò)增加或減少相關(guān)組分來(lái)驗(yàn)證該檢測(cè)系統(tǒng)有效靶向 RGNNV 的可行性。結(jié)果表明，只有當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)中所有組分都完整時(shí)，才會(huì)檢測(cè)到顯著的熒光信號(hào)。Cas13a 在 crRNA 引導(dǎo)下準(zhǔn)確靶向到目標(biāo)序列后，Cas13a 被激活并反式剪切 RNA 報(bào)告探針，發(fā)出熒光信號(hào)。
圖 4. CRISPR 系統(tǒng)檢測(cè)靶標(biāo) RNA 的可行性分析
03、CRISPR/Cas13a 檢測(cè)體系條件優(yōu)化
將 RNA 標(biāo)準(zhǔn)品和未擴(kuò)增的樣本 RNA 分開(kāi)檢測(cè)，測(cè)試發(fā)現(xiàn)，crRNA-CP 始終比 crRNA-RdRp 具有更高的檢測(cè)靈敏度。因此，使用 crRNA-CP 進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。為了評(píng)估反應(yīng)溫度對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的影響，測(cè)試了 25℃、37℃和 45℃。反應(yīng)速度隨溫度升高而增加，45℃組熒光值達(dá)到平臺(tái)僅需 1 分鐘，37℃組需 5 分鐘，25℃組需 15 分鐘以上。37℃組的熒光信號(hào)比其他兩組更強(qiáng)，因此 37℃為最佳反應(yīng)溫度。接下來(lái)，測(cè)試了 RNA 報(bào)告探針濃度對(duì)檢測(cè)信號(hào)的影響，結(jié)果表明，探針濃度在 500～700 nM 范圍內(nèi)檢測(cè)效果最好。最后，發(fā)現(xiàn)當(dāng) Cas 蛋白與 crRNA 的分子比為 4:1、3:1 時(shí)，Cas13a 表現(xiàn)出飽和活性。通過(guò)調(diào)整分析系統(tǒng)中 Cas 蛋白與 crRNA 的濃度來(lái)找到最佳比例。當(dāng) Cas13a 的濃度一定時(shí)，更多的 crRNA 并沒(méi)有增加熒光信號(hào)。相比之下，當(dāng)使用 Cas 蛋白與 crRNA 的濃度比例為 1:2 時(shí)獲得最高的檢測(cè)信號(hào)。Cas 蛋白與 crRNA 的濃度比例為 1:3 時(shí)，熒光信號(hào)開(kāi)始減少。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了適當(dāng)?shù)?Cas 蛋白和 crRNA 濃度在檢測(cè)中的重要性。
圖 5. CRISPR/Cas13a 檢測(cè)體系條件優(yōu)化
04、檢測(cè)靈敏度評(píng)估
為了測(cè)試基于 CRISPR/Cas13a 檢測(cè) RGNNV 的靈敏度，將 RGNNV 標(biāo)準(zhǔn)品 RNA 進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)褂眯聵?gòu)建的方法進(jìn)行檢測(cè)。加入目標(biāo) RNA 后，熒光信號(hào)發(fā)生了顯著變化。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的檢測(cè)系統(tǒng)可以檢測(cè)到至少 102 fM 的 RGNNV ssRNA。檢測(cè)儀器熒光采集結(jié)果顯示，當(dāng)靶 RNA 濃度低于 102 fM 時(shí)，測(cè)得的熒光信號(hào)強(qiáng)度與空白對(duì)照無(wú)顯著差異；當(dāng)濃度大于 102 fM 時(shí)，可以檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)。因此，優(yōu)化后的檢測(cè)系統(tǒng)可以檢測(cè)到至少 102 fM 的 RGNNV ssRNA。
圖 6. 檢測(cè) RGNNV 的靈敏度測(cè)試
05、檢測(cè)特異性評(píng)估
為了評(píng)估該檢測(cè)方法的特異性，使用同一系統(tǒng)檢測(cè)了 RGNNV、BFNNV 和 TPNNV 這三種病毒。BFNNV 的熒光信號(hào)強(qiáng)度與陰性對(duì)照沒(méi)有差異，但 TPNNV 引起了輕微的熒光信號(hào)（P<0.0001)，突出了該檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)其預(yù)期靶標(biāo) RGNNV 的較高特異性。
圖 7. RGNNV 病毒檢測(cè)系統(tǒng)的特異性
06、各地區(qū)魚(yú)群樣本的檢測(cè)
從國(guó)內(nèi)不同地區(qū)收集的感染 RGNNV 的幼魚(yú)樣本進(jìn)行了病毒 RNA 預(yù)處理和預(yù)擴(kuò)增，然后與陰性對(duì)照進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果與 qPCR 結(jié)果一致（18
圖 8. 各地區(qū)魚(yú)群樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)
總結(jié)
本研究建立了一種基于 CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)的 RGNNV 快速檢測(cè)方法。RGNNV 的最佳檢測(cè)系統(tǒng)包含 120 nM Cas13a、250 nM crRNA 和 600 nM RNA 報(bào)告探針，反應(yīng)體系在 37℃下孵育提高了切割效果。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，可以使用便攜式紫外燈或熒光檢測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè)，比傳統(tǒng)檢測(cè)方法更具時(shí)效性、便捷性和簡(jiǎn)單性，具有較高的應(yīng)用推廣前景。
參考文獻(xiàn)：
1.Huang F, Shan J, Liang K, et al. A new method to detect red spotted grouper neuro necrosis virus (RGNNV) based on CRISPR/Cas13a[J]. Aquaculture, 2022, 555: 738217.
2.Pascoli F, Guazzo A, Buratin A, et al. Lack of in vivo cross-protection of two different betanodavirus species RGNNV and SJNNV in European sea bass Dicentrachus labrax[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2019, 85: 85-89.
3. 陳文捷，劉曉丹，胡先勤，等。魚(yú)類(lèi)神經(jīng)壞死病毒研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014, 38(9): 1666-1672.
