從技術(shù)的角度看，隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，其研究范圍不再局限于轉(zhuǎn)錄組，而是擴(kuò)展到了基因組、免疫組、表觀組、蛋白組等多組學(xué)水平，研究對(duì)象涉及染色質(zhì)、DNA、表觀、轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白、細(xì)胞表面蛋白等多種分子信息?；趩渭?xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)，細(xì)胞聚類(lèi)既可以通過(guò)來(lái)自相似細(xì)胞群的參考數(shù)據(jù)集中現(xiàn)有的細(xì)胞類(lèi)型注釋對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)，也可以執(zhí)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)來(lái)識(shí)別相似細(xì)胞組，并利用其它分子層面數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行的更精細(xì)的劃分。
例如轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可用于鑒定不同細(xì)胞類(lèi)型或狀態(tài)之間差異表達(dá)的基因，基因組數(shù)據(jù)能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)基因拷貝數(shù)變化、單堿基突變、插入缺失及等信息，染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)可用于鑒定可及區(qū)域和富集的 DNA 基序，表觀組數(shù)據(jù)可用于鑒定不同細(xì)胞類(lèi)型或狀態(tài)之間的差異甲基化區(qū)域，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)可用于了解細(xì)胞間相互作用等。此外，近年來(lái)新出現(xiàn)的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法及其數(shù)據(jù)整合算法，提供了細(xì)胞的空間信息，為單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了補(bǔ)充。
而從應(yīng)用角度看，在腫瘤發(fā)生等復(fù)雜的生物過(guò)程中，異質(zhì)性同時(shí)存在于基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組、免疫組等多層面，基因相同的腫瘤細(xì)胞可能具有不同的 DNA 甲基化、基因表達(dá)、克隆擴(kuò)增模式，因此常常需要多組學(xué)技術(shù)才能更加準(zhǔn)確地將它們分類(lèi)為不同亞群，揭示更深層的生物學(xué)機(jī)制。
圖 4-5 多組學(xué)數(shù)據(jù)整合下的細(xì)胞聚類(lèi)與注釋
(Tim et al. Nature reviews genetics 2018)
圖 4-6 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)擴(kuò)展到多組學(xué)和多分子水平
單細(xì)胞免疫組測(cè)序
免疫組庫(kù)是指在特定時(shí)間段內(nèi)，機(jī)體所有有功能的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞的總和。人體的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)主要依靠于 T 淋巴細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞表面的 T 細(xì)胞受體（TCR) 和 B 細(xì)胞受體（BCR)，其受體上的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR) 與 MHC- 抗原肽分子進(jìn)行識(shí)別并特異性結(jié)合。BCR/TCR 存在一塊區(qū)域叫作互補(bǔ)決定區(qū)（CDR), 由 CDR1、CDR2、CDR3 組成，CDR1 和 CDR2 都是由 V 基因編碼，而 CDR3 是由 V、D、J 三個(gè)基因編碼形成，所以 CDR3 多樣性程度高，是主要參與抗原識(shí)別的區(qū)域。
免疫組庫(kù)測(cè)序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)) 是以 T/B 淋巴細(xì)胞為研究目標(biāo)，通過(guò)多重 PCR 或 5’RACE 技術(shù)特異性擴(kuò)增決定 B 淋巴細(xì)胞受體（BCR) 或 T 淋巴細(xì)胞受體（TCR) 多樣性的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR3 區(qū)），再結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，全面評(píng)估免疫系統(tǒng)的多樣性，深入挖掘免疫組庫(kù)與疾病的關(guān)系。免疫組庫(kù)測(cè)序技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，目前已經(jīng)在腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)、白血病微小殘留病變監(jiān)測(cè)、自身免疫性疾病診斷和疾病生物標(biāo)志物開(kāi)發(fā)等方面取得了一定的進(jìn)展。
單細(xì)胞免疫組庫(kù)測(cè)序是在免疫組庫(kù)測(cè)序加入單細(xì)胞分選技術(shù)，在單細(xì)胞水平進(jìn)行的免疫組庫(kù)測(cè)序，可在免疫組庫(kù)測(cè)序提供的信息基礎(chǔ)上，揭示細(xì)胞的免疫異質(zhì)性信息，更加全面、深入地揭示腫瘤、疾病中的免疫機(jī)制。
單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)
盡管單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組能夠揭示單細(xì)胞水平的 DNA 和 RNA 結(jié)構(gòu)，但是在細(xì)胞內(nèi)主要發(fā)揮功能的成分是蛋白質(zhì)，因而研究單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)成為新興領(lǐng)域。單個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的總量通常小于 1ng，比用于常規(guī)蛋白質(zhì)組分析的量至少減少 100 倍，而且數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)具有高度的動(dòng)態(tài)范圍和化學(xué)計(jì)量，因而單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)目前還存在諸多難點(diǎn)，技術(shù)仍處于早期發(fā)展階段。前文介紹的質(zhì)譜流式技術(shù)和其他流式技術(shù)都是目前已有的重要的單細(xì)胞蛋白組學(xué)技術(shù)。
目前，單細(xì)胞蛋白組學(xué)技術(shù)主要對(duì)細(xì)胞表面蛋白的檢測(cè)，通過(guò)類(lèi)似于流式細(xì)胞術(shù)的表面抗體標(biāo)記技術(shù)，將細(xì)胞的免疫表型與轉(zhuǎn)錄組學(xué)得到的細(xì)胞群相匹配。不同于流式細(xì)胞術(shù)的熒光標(biāo)記抗體，單細(xì)胞表型的蛋白質(zhì)組學(xué)使用寡核苷酸耦合的抗體，從而不受限于熒光通道和熒光補(bǔ)償，可以在單細(xì)胞表面標(biāo)記上百種甚至上千種蛋白，從而顯著提高了基于流式細(xì)胞術(shù)和質(zhì)譜流式的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的通量。
主流的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的檢測(cè)有 BD 公司的 AbSeq 和 Biolgend 公司的 TotalSeq。
BD 公司的 AbSeq 平臺(tái)，結(jié)合 BD 公司的 Rhapsody，將單細(xì)胞表面標(biāo)記和測(cè)序相結(jié)合，基于細(xì)胞表面的標(biāo)記的 Hashtag 抗體，能夠?qū)Σ煌瑯悠穪?lái)源的細(xì)胞進(jìn)行 barcode 標(biāo)記，提高通量、降低成本。此外如 4.2 章所述，有自身對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組和免疫組的后續(xù)流程。同為 Rhapsody 系統(tǒng)，使用的蜂巢板技術(shù)是依靠細(xì)胞重力自由沉降，避免了 10x Genomics 中存在的碰撞，所以對(duì)于起始細(xì)胞活性要求較低。此外，BDTMAbSeq 抗體 - 寡核苷酸復(fù)合物利用寡核苷酸測(cè)序來(lái)獲得多重蛋白檢測(cè)，用于單細(xì)胞水平的多組學(xué)分析，使得研究者可以在同一實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)（抗體 - 抗原相互作用分析）和 mRNA 表達(dá)。BD 多樣本分析試劑盒，同樣利用抗體偶聯(lián)樣本標(biāo)簽（寡核苷酸序列）對(duì)不同來(lái)源樣本進(jìn)行標(biāo)記，然后混樣進(jìn)行檢測(cè)，可以顯著降低時(shí)間成本和實(shí)驗(yàn)成本（較多可實(shí)現(xiàn) 12 個(gè)樣本的同時(shí)檢測(cè)），還可以通過(guò)樣本標(biāo)簽識(shí)別多細(xì)胞數(shù)據(jù)，提高單細(xì)胞數(shù)據(jù)質(zhì)量。
Biolgend 的 TotalSeq 技術(shù)是目前應(yīng)用較廣泛的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組方案。TotalSeq 無(wú)縫對(duì)接現(xiàn)有的單細(xì)胞 RNA 測(cè)序工作流程中，包括 Drop-Seq 和 10x Genomics 提供的工作流程，如 Cellranger 等，使數(shù)據(jù)分析效率顯著提高。同時(shí)提供三類(lèi)不同的寡核苷酸偶聯(lián)抗體：TotalSeqA, B, C，分別對(duì)應(yīng) 10x Genomics 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和免疫組的應(yīng)用?，F(xiàn)有的表面標(biāo)記抗體超過(guò)一千種，能夠?qū)渭?xì)胞的免疫表型進(jìn)行全面解讀。同時(shí)開(kāi)發(fā) cell-hashing 的技術(shù)，使用 hashtag 抗體對(duì)不同樣本進(jìn)行標(biāo)記，從而在后續(xù)分析中通過(guò)去卷積的方法獲得對(duì)應(yīng)樣品的數(shù)據(jù)信息，顯著提高輸入樣品的通量和實(shí)驗(yàn)成本。此外，Biolegend 提供預(yù)制混合好的凍干的抗體組合，使用方便且通量提高。
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